肿瘤的过继性细胞免疫治疗

肿瘤的过继性细胞免疫治疗学习内容与要求•掌握肿瘤的过继性细胞免疫治疗的定义及原理。•熟悉LAK、TIL、CD3AK、CIK、CTL细胞的制备方法及研究进展。概述•肿瘤的过继性细胞免疫治疗(Adoptivecellularimmunotherapy，ACI或AIT)是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞(特异性的和相对特异性的)直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。简要历史回顾•20世纪60年代：发现细胞免疫引起组织器官移植排斥启发人们应用过继性细胞免疫治疗肿瘤。•20世纪80年代：85年，Rosenberg报道LAK/IL-2治疗晚期恶性肿瘤具有疗效。86年，报道TIL。•1991年，斯坦福大学的SchmidtWolf等报道了CIK细胞。一）淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokineactivatedkillercells,LAK)病人外周淋巴细胞（体外）IL-2激活回输病人LAK治疗方法优点•只对肿瘤细胞产生细胞毒性；•基本无毒副作用；•不依赖荷瘤者免疫功能；•可与其他疗法联合使用；•无免疫抑制作用。LAK细胞杀伤肿瘤细胞的作用机制•LAK细胞的异质性•LAK细胞表面存在多种与肿瘤识别相关的特异性分子。•LAK杀伤肿瘤细胞不受MHC限制LAK细胞杀伤肿瘤细胞的作用机制•效靶细胞结合后，通过分泌细胞毒颗粒，在Ca2+存在时，释放其中的穿孔素、丝氨酸酯酶、TNF样分子等杀伤介质，直接杀伤靶细胞。•通过LAK细胞表面的杀伤分子(如m-LT)直接杀伤靶细胞。•通过分泌其他细胞因子间接杀伤靶细胞。同种异体LAK细胞(Allo-LAK)•Allo-LAK细胞的有效性•Allo-LAK细胞的安全性•LAK细胞分布特点和临床疗效一致，即对肺、肝、肾等器官肿瘤疗效较好，而对其他器官的肿瘤疗效不明显。LAK细胞体内回输后组织器官分布LAK细胞的制备•LAK细胞的来源:患者自体外周血、6～7个月龄的胎儿胸腺和脾脏细胞、同种异体外周血、脐带血。•细胞因子对LAK的诱导IL-2/IL-15/IL-7（二）肿瘤浸润性淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte,TIL)1）肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）激活病人Tumor分离淋巴细胞IL-2回输TIL细胞的特征•TIL细胞的异质性CD3、CD4、CD8T细胞•TIL的作用机理诱导肿瘤细胞凋亡机制：TIL分泌细胞因子诱导调亡；释放穿孔素引起凋亡。影响TIL扩增和转化的因素影响因素作用抗原辐射灭活的自身肿瘤抗原刺激TIL生长高水平表达HLA-1抗原的肿瘤细胞诱导TIL中CD4＋CTL细胞产生缺乏HLA-1抗原的肿瘤细胞诱导TIL中CD4＋细胞产生细胞因子低浓度IL-2(10-20U/ml)诱导对自身肿瘤细胞的特异性杀伤IL-2+IL-4促进TIL细胞的增殖GM-CSF+IL-2促进CTL细胞的增殖IL-6促进肾癌来源的TIL增殖和特异性与非特异性的CTL的产生IL-7促进TIL的增殖GM-CSF+IL-2扩增TIL和提高TIL的杀伤活性抑制因子IL-10+TGF-β抑制TIL生长和杀伤活性前列腺素抑制TIL的转化细胞毒药物对TIL的影响•化疗药物对TIL毒性大于对肿瘤细胞的杀伤性，因而在应用TIL过继免疫治疗时不宜同时使用化疗药物.TIL细胞的制备方法•TIL来源：①手术切除或活检的瘤体组织；②癌性胸水、腹水中淋巴细胞；③转移淋巴结。•TIL体外激活：(1)白介素系统；(2)TNF-α与IL-2的协同作用；(3)TIL与自身瘤细胞、自身淋巴细胞共同培养；(4)淋巴因子基因转导TIL；(5)双功能抗体导向TIL。TIL的临床应用及展望•TIL细胞的临床应用受到许多因素制约•发展方向：①增强TIL细胞增殖力以及特异性杀伤肿瘤细胞活性；②与其它细胞因子联合治疗，提高疗效；③改变TIL细胞的输注途径，缩短距离，使TIL细胞能更有效地达到并聚集瘤体处；④提高T细胞分泌Th1型细胞因子的能力，抑制分泌Th2型细胞因子。抗CD3McAb激活的杀伤细胞(CD3AK)•CD3AK细胞是指用特定的抗CD3McAb激发免疫活性细胞的增殖并诱导相关细胞因子的表达和分泌，从而产生的可有效攻击肿瘤的杀伤细胞，故称之为抗CD3McAb激活的杀伤细胞(anti-CD3McAbactivatedkillercells,CD3AK)。CD3AK细胞的免疫学特征•CD3AK细胞中含有高比例的CD3＋细胞和CD56＋或CD57＋细胞。•通过自体辅佐细胞(单核或巨噬细胞)提呈处理过的抗原作用于TCR可激活T细胞。作用于TCR-CD3复合物的抗CD3McAb可模拟这种效应。CD3AK细胞制备•人外周血单个核细胞(淋巴细胞)加入CD3McAb再加入低剂量的IL-2CD3AK细胞治疗肿瘤的优点•CD3AK细胞选择性地杀伤肿瘤细胞•CD3AK细胞具有更为广谱的杀伤肿瘤作用•CD3AK细胞增殖能力大大优于LAK细胞•CD3AK细胞的增殖和维持可以不依赖或少依赖外源的IL-2多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokinesinducedkillers,CIK)•将人外周血或骨髓单个核细胞在体外用多种细胞因子与CD3McAb共同培养一段时间后获得的杀伤细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokines-inducedkillercells,CIK细胞)CIK细胞的制备分离获取外周血单个核细胞诱导活化(IL-2,,Anti-CD3McAb,IFN-γ,PHA)高效扩增（IL-2,Anti-CD3McAb,IFN-γ,PHA）外周血收集CIK/TIL，全身/局部回输细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyteCTL)•T淋巴细胞通过TCR-CD3复合物、MHC分子、抗原肽及协同刺激分子共同刺激，增强T淋巴细胞增殖及效应。CTL细胞的制备•①分离肿瘤细胞；②调变肿瘤细胞：用直接导入方法或逆转录病毒介导的转移方法向肿瘤细胞导入B7基因，并检测肿瘤细胞表达B7分子的情况；③诱导CTL：用调变修饰后的肿瘤细胞与效应细胞共同培养，诱导高活性的CTL；④分离CTL用于临床治疗。过继性免疫疗法存在的问题•由于肿瘤细胞的不均一性及效应细胞的异质性造成疗效的不确定性;•体外大量扩增过继免疫细胞技术有待开发；•输注的细胞向肿瘤组织的聚集性弱;•体内过继免疫机制的进一步明确；•与其它肿瘤治疗方法的有机整合需要进一步完善；•缺乏统一的能指示临床转归的的免疫检测指标；单克隆抗体与肿瘤分子靶向治疗概述•肿瘤分子靶向治疗：利用肿瘤组织或细胞所具有的特异性(或相对特异的)结构分子作为靶点，使用某些能与这些靶分子特异结合的抗体、配体等达到直接治疗或导向治疗目的的一大类治疗方法。分子靶向治疗的靶点•细胞受体•信号转导•细胞周期•血管生成单克隆抗体在肿瘤分子靶向治疗中的地位•肿瘤抗体靶向治疗的发展历史•肿瘤单克隆抗体靶向治疗的作用机制肿瘤抗体靶向治疗的发展历史•鼠源性多克隆抗血清是最早被用于治疗肿瘤的抗体分子•1975年利用杂交瘤技术成功地制备McAb，大大推动了肿瘤生物靶向治疗的进展•近十年来已研究制备出人鼠嵌合抗体、人源化抗体和完全人源抗体抗体的结构和功能抗体作为肿瘤的靶向治疗得益于抗体两个关键性技术的突破：•人鼠嵌合抗体、人源化抗体和完全人源抗体技术及制备技术的成熟，基本上可以克服鼠源性抗体用于人体产生抗抗体的问题•抗体库的建立和筛选以及多价重组抗体制备技术的发展，使人们能够直接获得特异性强和亲和力高的单克隆抗体。1人一鼠嵌合抗体(ChimericAntibodies)人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。①嵌合抗体鼠源V区人源C区小鼠杂交瘤细胞人B细胞V区基因C区基因鼠源V区鼠源C区构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。构建重组表达载体2鼠单抗可变区的人源化尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。②人源化抗体小鼠杂交瘤细胞人B细胞CDR区基因V支架区C区基因③完全人源化抗体小鼠B细胞敲除小鼠Ig基因人Ig基因Ag骨髓瘤细胞杂交瘤细胞由于抗体技术的发展，至今全球已报道的抗体有１０多万种，其中基因工程抗体有１０００多种，人源化抗体２００多种。目前国际上已有５００多种抗体用于诊断和治疗，ＦＤＡ至今已批准１８种抗体上市，其中８种是用于治疗肿瘤的靶向抗体。单克隆抗体靶向治疗至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，其中抗体药物有15种2003年治疗用单抗的销售总额已超过52亿美元;2006年预计50~60个治疗性单抗上市;2010年预计单抗销售额200亿美元;美国已占全球单抗市场90%—一支独秀;完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段。肿瘤单克隆抗体靶向治疗的作用机制•直接作用•ADCC作用：(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)•CDC作用（complement-dependentcytoxicity,CDC）•通过McAb的主动免疫2、ADCC•CDC作用：抗体的Fc段与补体成分C1q结合，通过经典途径激活补体，导致肿瘤细胞溶解死亡。间接作用：抗体结合同位素、化疗药物或细胞毒素，通过携带抗肿瘤制剂，直接抵达肿瘤局部，提高抗肿瘤制剂的疗效。抗人白细胞分化抗原的抗体治疗•白细胞分化抗原（CD分子）是白细胞在正常分化成熟不同谱系和不同阶段以及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。•多种抗人白细胞分化抗原已用于肿瘤的治疗靶点。抗CD20抗体•85%-90%的淋巴瘤属于B细胞来源。•CD20存在于超过90%B淋巴细胞。•造血干细胞、浆细胞、淋巴祖细胞以及其它组织均无表达，人体血清中亦无游离CD20的存在。CD20不会轻易从细胞膜上脱落。•抗CD20抗体（美罗华（Rituximab，Rituxan），第一个通过FDA批准应用于临床的人鼠嵌合型单抗。•作用机制：激活补体介导的溶解及参与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，有效杀灭CD20阳性的B淋巴瘤细胞；增加化疗药物的细胞毒作用并诱导凋亡。同位素结合性抗体•同位素免疫结合可用于抗体携带同位素到达肿瘤细胞，产生杀肿瘤的局部治疗效果；还可作为临床检测肿瘤的一种敏感的工具。•Zevalin（泽娃灵）钇９０（90Y）同位素标记的鼠源性抗CD20抗体与癌变的B—淋巴细胞表面的CD-20抗原结合，杀死癌细胞。抗CD33结合性抗体•CD33可以在90%的AML原始细胞上被检出。几乎在所有的正常早期髓系、红系前体细胞上均有表达，但在正常造血干细胞或非造血细胞上并不表达。•没有证据表明与CD33抗体结合可以引起凋亡。•单抗能特异性捕捉肿瘤抗原，用抗体携带化疗药物，可提高化疗药物在肿瘤的局部剂量，减少化疗药物的全身毒性反应。•2000年FDA批准用于治疗急性复发性髓性白血病的Mylotarg（麦罗塔）是由抗CD33单抗与抗肿瘤抗生素calicheamicin（卡奇霉素）构成的偶联物，也是第一个获批准用于临床治疗的以化疗药物为“弹头”的抗体药物。肿瘤放射免疫靶向治疗•利用特异性抗体作载体，与能释放β或α射线的放射性核素耦合，注入体内与肿瘤细胞特异性结合，实现对瘤体的内照射治疗。•一般用于治疗白血病及淋巴瘤。鼠源性抗体作载体。阻断信号传导通路的靶向治疗•许多肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。•肿瘤细胞特别是EGFR+的肿瘤细胞的生长明显依赖于EGFR信号传导，其EGFR表达水平可比正常细胞高几千倍。抗EGFR的单抗（Erbitux）•作用机制：特异性与表皮生长因子受体（EGFR,