13看第十三章-植物细胞的遗传转化

植物遗传转化系统的建立张志胜GuangdongProvincialKeyLaboratoryofPlantMolecularBreeding，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，[e-mail]内容一、植物遗传转化系统概述二、植物遗传转化受体系统的建立三、植物基因转化的方法四、转基因植株的再生及其检测一、植物遗传转化系统概述(generalsituationofplantgenetictransformationsystem)1、植物遗传转化（plantgenetictransformation）是指利用重组DNA技术，将外源基因导入植物细胞，外源基因与受体植物染色体整合并稳定遗传和表达的过程或技术。植物遗传转化技术是分子育种的核心技术之一，已经成为培育植物新品种的有效方法之一.0100020003000400050006000700080009000100001996199719981999200020012002200320042005年份面积(万公顷)全球转基因作物种植面积1、怎样开展遗传转化工作确定育种目标获得目的基因受体材料的选择工程载体的构建遗传转化受体系统的建立采用一定的方法将目的基因导入细胞转化细胞的筛选和植株再生转基因植株鉴定和目标性状鉴定植物遗传转化受体系统是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并接受外源基因的整合，对用于转化选择的抗生素敏感的系统（王关林和方宏筠，1998）二、植物遗传转化受体系统的建立1、植物遗传转化常用的受体（1）植物组织和器官：幼叶、未成熟子叶、子叶、未成熟胚、成熟胚、子叶节、子房、下胚轴、茎尖、花粉、球茎、根和鳞茎等。植物遗传转化受体系统的建立是基因工程的重要环节（2）中间繁殖体：在离体培养过程中形成的具有一定形态结构的中间繁殖材料。包括：原球茎、根状茎、丛芽、胚状体、愈伤组织和悬浮细胞等。（3）原生质体2、植物基因转化受体的条件●高效稳定的再生能力●较高的遗传稳定性●具有稳定的来源●对抗生素敏感抑菌抗生素：在农杆菌介导的遗传转化中用来抑制农杆菌生长的抗生素。选择性抗生素：用来对转化子进行早期筛选的抗生素作为选择性抗生素的条件■植物材料对所选用的抗生素有一定的敏感性■抗生素对受体植物没有剧烈的毒性■常用的选择性抗生素：抑菌抗生素：氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素选择性抗生素：潮霉素、卡那霉素●农杆菌敏感性LAB4404EHA1053、植物基因转化系统的类型及其特性（1）组织器官受体系统组织器官受体系统是指以植物的组织器官为转基因的受体，然后通过脱分化和再分化获得再生植株的受体系统。●特点：■受体来源广泛，容易获得；■适合于各种遗传转化方法，特别是农杆菌介导法；■适应于各种能够通过组织培养获得再生植株的植物；■获得再生植株的周期长。叶盘法、生殖细胞受体系统烟草叶盘遗传转化体系，其阳性转基因植株频率可达57.1%（张宁等，2004）大白菜，最高转化频率可达5.74%（杨广东等，2002）水稻成熟胚、幼胚、幼穗遗传转化受体系统。幼胚最高，基因枪法比农杆菌介导法高（王芋华等，2004）。（2）中间繁殖体受体系统●是指以植物组织培养过程中产生的中间繁殖体为转基因的受体，然后通过再分化获得再生植株的受体系统。●特点：最理想的基因转化受体体统■获得再生植株周期短■快速简单方便■适合多种转化方法■接受外源基因能力强，转化率高通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立了马铃薯栽培品种“费乌瑞它(Favorita)”茎段和试管薯的遗传转化体系,其转化频率分别可达25.6%和36.8%（张宁等，2004）（3）原生质体受体系统●以原生质体为受体材料，然后通过原生质体培养获得再生植株的受体系统。●特点：■转化率高■获得再生植株无性系变异多，转化的外源基因稳定性差■出现的嵌合体少■技术难度大（4）生殖细胞受体系统以生殖细胞如花粉和卵细胞为受体进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。利用生殖细胞进行基因转化有两种途径：一是利用小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，从而建立单倍体的基因转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉导人法、花粉粒浸泡法和子房微注射法等。特点A、利用单倍体遗传转化受体系统进行基因转化，避免了基因显隐性的影响，有利于基因的充分表达，通过染色体加倍后即可使基因纯合，缩短了目的基因纯合的时间，加快了转基因育种过程；B、花粉管通道法和子房注射法由于操作简单，受实验室条件限制较小，已成为目前国内常用的转基因方法之一，同时，花粉管通道法是利用植物自身的有性生殖过程，有利于将现代的分子育种与常规育种紧密结合，也有利于目的基因在转基因后代中的稳定表达；C、受体取材受到季节的影响大。利用花粉管通道法等进行遗传转化只能在短暂的开花期内进行，这是限制该系统应用的主要原因之一。4、遗传转化受体系统的建立（1）高频再生系统的建立①理想的高频再生系统应具备的条件具有高的中间繁殖体的诱导率具有高的植株再生能力易培养，重复性好体细胞无性系变异少②高频再生系统建立的方法高频再生系统的建立是建立高效稳定转基因受体系统的基础●外植体的选择外植体的生理年龄外植体的生理状态外植体的遗传背景选择的适宜外植体是建立高频再生系统的前提培养基的筛选是高频再生系统的核心培养基影响组培效果培养基影响变异程度培养基影响分化途径●培养基●培养基◆基本培养基◆激素的选择：生长素（2，4-D、NAA、IAA、IBA和2，4，5-T）和细胞分裂素（ZT、BAP、6-BA、2iP和KT）◆糖的种类和浓度◆有机附加物的选择●培养条件培养条件是影响高频再生系统的重要因素影响组培的效果影响变异频率温度光照：强度、光周期和光质高频再生系统的评价中间繁殖体诱导率中间繁殖体增殖率植株分化率变异率移栽成活率③抗生素敏感性试验选择对抗生素敏感的受体材料是建立高效稳定转基因受体系统的保证（农杆菌介导法）外植体诱导培养基含不同浓度抗生素培养基植株再生综合评价④农杆菌敏感性试验选择对农杆菌敏感的受体材料是建立高效稳定转基因受体系统的关键（农杆菌介导法）不同植物材料农杆菌菌株浸染敏感性评价（结瘤或发根率，发生时间，生长状况等）（2）受体系统常见的问题及其解决途径①再生能力及其遗传稳定性选择合适外植体减少继代次数选择合适培养基等②愈伤组织褐变③再生植株玻璃化三、植物遗传转化的方法（1）载体转化系统：农杆菌介导法、植物病毒载体法；（2）直接转化系统：化学法（PEG法和脂质体法）和物理法（基因枪法、电击法和显微注射法等）；（3）种质转化系统：花粉管通道法、萌动种胚浸泡法、子房和胚囊注射法等。(一）农杆菌介导转化法1、根癌农杆菌介导转化原理农杆菌能浸染植物细胞并将其中所带有的质粒中一部分T-DNA导入植物细胞中，并整合到植物核DNA上，然后在植物细胞中得到转录和翻译，表达出目的基因的性状。2、根癌农杆菌Ti质粒转化的基本程序（1）受体系统的建立（2）Ti质粒转化载体的构建（3）目的基因的转化与鉴定目的基因的转化程序根癌农杆菌的培养、纯化、保存Vir区基因的活化和工程菌液的制备外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养外植体脱菌及选择培养转化体的选择和植株再生转基因植株的鉴定叶盘转化法打孔器从消毒叶片上获得叶盘在工程菌液中浸数秒培养基上共培养2~3天在含有抑菌剂的培养基上培养转化体选择和再生不同作物适宜的接种时间和接种菌液浓度*外植体种类接种时间/min接种菌液浓度/OD共培养时间（d）小麦未成熟胚和胚性愈伤组织600.5～1.02～3水稻胚性愈伤组织151.0～1.52玉米未成熟胚101.02～3棉花下胚轴1～30.3～0.62大豆子叶10～300.3～0.62原生质体共培养转化法原生质体分离原生质体培养共培养2~3天（工程菌：原生质体=1：1000）去菌培养和转化体的选择植株再生3、影响农杆菌介导法转化效率的因素（1）农杆菌（2）质粒（3）受体材料（4）共培养：时间、培养基和培养条件（5）抗氧化剂（二）基因枪法particlegunParticlebombardmentBiolisticsHighvelocitymicroprojectile1、基本原理利用火药爆炸、高压放电或高压惰性气体作驱动力，将包裹有外源DNA的钨粉或金粉颗粒加速，射击真空室中的靶细胞或组织，微粒上的DNA进入到细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而达到将外源基因导入植物的目的2、方法和步骤（1）DNA微弹的制备60~100mg金粉1ml无水乙醇中，超声波洗涤离心去乙醇1ml无菌水洗涤2次后，加1ml无菌水重悬25l悬浮液+25lDNA（1g/l），混均，再加入25l2.5mol/LCaCl2，手指振荡5次，加入20l40%PEG4000，手指振荡5次，混合液在室温下静置10min离心5min，移去50-60l上清，其余混均，每次用量8l（2）材料的准备，将材料接入培养皿中，把培养皿放入基因枪的样品室中，并对准子弹发射中轴。（3）按基因枪操作程序进行微弹轰击（4）轰击后材料的培养和鉴定3、影响基因枪转化效率的因素（1）金属微粒的种类和直径（2）沉淀助溶剂（3）DNA纯度和浓度（4）轰击参数：粒子速度、入射速度、阻挡板至样品室高度、轰击次数等（5）植物受体系统基因枪转化法的特点不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞作为靶材料操作简便外源基因随机整合，并且常常是多拷贝整合，因而易造成转基因沉默和转基因后代目的基因分离复杂化与农杆菌转化法相比，其转化效率还较低由于转化事件总是发生在少数细胞内，这就带来了如何富集转化细胞而淘汰未转化细胞的问题——筛选(screening).同时，即使在非常严格的筛选条件下再生的转化体也仍可能存在假转化体(或交叉保护的逃脱体escapee),所以必须对转化体（transformants）进行严格的鉴定，以确证其为转基因植株（transgenicplant）四、转基因植株的再生及其检测1、转化体的筛选利用选择标记基因，借助一定的手段使已转化的细胞存活下来，而杀死未转化的细胞。选择标记基因通常与目的基因置于同一质粒载体。亦可将二者分置于不同质粒载体进行共转化，如此便于在后代筛选出无标记基因的转化植株。通常目的基因所编码的产物不易检测，在转化初期无法判断该基因是否已导入植物。为此，可将一个易于检测产物的基因与目的基因相连，共同转化植物，借助该基因的表达检测即可报告目的基因是否已同时导入受体。这个产物易于检测、用于报告目的片段是否导入受体细胞的基因称之报告基因必须具有两大特点：1.其表达产物及产物的类似功能在未转化的植物细胞内不存在2.便于检测报告基因植物转化常用报告基因及标记基因基因中文名基因来源基因产物检测方法选择性试剂gusβ—葡萄糖苷酸酶基因细菌β—葡萄糖苷酸酶荧光分析法及组织化学分析法luc荧光素酶基因萤火虫荧光素酶光分析法gfp绿色荧光蛋白基因水母绿色荧光蛋白荧光显微分析法nos胭脂碱合成酶基因细菌胭脂碱合成酶菲醌显色报告基因ocs章鱼碱合成酶基因细菌章鱼碱合成酶菲醌显色barGlufosinate抗性基因细菌PAT酶Basta除草剂或Glufosinate或PPThph潮霉素磷酸转移酶基因细菌潮霉素磷酸转移酶潮霉素aphII新霉素磷酸转移酶基因细菌新霉素磷酸转移酶卡那霉素G418筛选标记基因aroA草甘膦抗性基因细菌EPSPs草甘膦目的基因的整合鉴定如PCR、Southernblot——DNA水平目的基因的表达鉴定如Northernblot——转录水平Westernblot——翻译水平生物学鉴定或田间表型鉴定2转化体的鉴定(verification)转基因的整合鉴定——PCR检测CKPT0转化植株CK：非转化对照P：hpt质粒提取转化植株基因组DNA↓设计目的基因特异引物↓以基因组DNA为模板进行PCR