凝血分析的质量控制

一、概述:从1949年美国CollegeofAmericanPathologists（简称CAP）首先开始研究临床实验室室内质量控制（简称质控）问题，美国学者Levery和Jenning于1950年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉开序幕。到70年代，实验室质量控制进入一个新的阶段—全面质量管理，推行GoodLaboratoryParctice（简称GLP）。进入80年代末期，GLP的统一标准产生了，发展到”认证实验室”管理阶段。全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控图的统计学质控的目的是检出差错。统计学的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重要环节。1.基本概念۩质量控制（QuailityControl,Q.C）质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的。1）确定控制的对象；2）规定控制对象的标准（预期值）；3）制定或选择控制方法和手段；4）测量实际数据；5）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。6）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的“控制限”进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的“可追查”性原因。“可追逆”性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。“控制限”是通过统计计算出来的，详细介绍见室内质控程序。۩标准品•国际标准品由WHO或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法测定的定值材料。•国际生物学活性标准品根据生物学反应由WHO或相应组织标定的国际活性单位的材料。•参考标准血清国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和鉴定方法准确性。组织凝血活酶标准化应用的国际参考品（internationalreferencepreparationIRP），有下列几种：（1）单一组织凝血活酶国际参考品：是一种组织提取物的生理盐水悬液制剂。WHO在英国使用的统一标准的“英国比较凝血活酶”（Britishcomparativethromboplastin,BCT）为基础，制备WHO的原级凝血活酶参考品（primaryreferencepreparation），如人脑组织凝血活酶，编号67/40。同时又以BCT67/40为基础标化了次级参考品（secondaryreferencepreparation）。如牛脑组织凝血活酶，编号为68/434；兔脑为70/178。后来WHO还公布了一些次级组织凝血活酶参考品，如人脑或胎盘制剂，如BCT/253；兔或兔、猴组织混合制剂，如RBT/79等。（2）复合组织凝血活酶国际参考品：它是组织提取物的生理盐水悬液中加入适量的纤维蛋白原、因子V和氯化钙组成的制剂，如牛组织凝血活酶OBT/79等。目前世界各国都广泛应用WHO的这些参考品来校正本国或本地区制备或生产的组织凝血活酶参考物。这样使世界范围内有了多种组织凝血活酶参考品。（3）组织凝血活酶工作制剂（workingpreparation,WP）的国际敏感度指数（internationalsensitivityindex,ISI）：由于不同组织凝血活酶对凝血因子的敏感性不同。为了使不同敏感性的组织凝血活酶在检测PT中能得到同样的结果，必须要制定一个共同的敏感性指标。这就需要通过自制的试剂与国际参考品（IRP）进行比较，然后得出一个校正值。具体的方法如下：①用国际参考品（IRP）标定国家、地区或本实验室的参考制剂（referencepreparation,RP）。②用实验室参考制剂（RP）标定工作制剂（WP）。1）标本：2份正常人血浆和6份口服抗凝剂达6周的患者血浆，连收10天，共60份标本。2）测定：按一定顺序进行测定，每份标本重复测定2次。将PT测定的结果（秒）点在双对数坐标纸上，横坐标代表WP的PT测定结果，纵坐标代表RP的PT测定结果，画出最佳的各点拟合直线，得出定标曲线，通过WP/RP比值，或回归方程求出斜率b。3）计算WP的ISI值：ISI值愈接近于1.0，表明组织凝血活酶试剂愈敏感，因此，生产和出售组织凝血活酶试剂的厂商，必须在产品上标有ISI。二、凝血检验的质量控制(一)标本采集的质量控制:血标本的采取应注意的问题1．PT、APTT凝血实验检查均使用静脉血。采血人员应技术熟练，“一针见血”，以防止组织损伤，外源性凝血因子进入针管。2．凝血实验标本最好不与其他实验一起采集，否则由于标本的分配、分装等而使血液停留在针管的时间延长，和一般血液采集，进入容器及进行实验所用时间越短，所分析的凝血因子被保护得越好。从输液三通管取血的做法不可取。3．取血时病人应松驰，环境温暖，防止静脉孪缩，止血带的压力要尽可能小，压力大及束缚时间长可影响局部血液的浓缩和内皮细胞释放t-PA,后者将引起纤溶活性增强，血小板释放应及某些凝血因子活性增加。取血注射器的针头长短和内径应标准化，国际上推荐用21G1.5或20G1.5针头。取血时，拉针栓的速度要慢而均匀，使血液平衡地进入注射器，防止气泡的产生。4．一旦取样完毕，立即与抗凝剂充分混合。一般提倡使用真空采血管。此管有充分的透明度，根据取血量设计，有2.0ml、5.0ml、10ml各种血液收集管，真空负压并定量的抗凝剂，能保证抗凝剂与取血量的比例，且能有充分的空间便于血液和抗凝剂混合。5．应该用硅化玻璃或塑料注射器采血。考虑到结果的精确性，应将试管刻度的可能误差控制在既定体积的10%以内。6．采血后标本在低温保存且在一定时间范围内。笔者曾对不同条件保存的血浆因子变化进行了探讨，结果显示在32℃保存血浆6小时、12小时、24小时Ⅷ因子活性可分别消失50%、60%和95%，即使保存在4℃内也分别消失5%、55%、70%。V因子活性在32℃分别消失25%、40%和80%，而在4℃则仅损失0%、5%、10%。因此测定APTT的血浆在-80℃至少可保存1个月、4℃为6小时、20℃为6小时、而32℃仅为2小时，做PT血浆，在4℃为24小时，20℃为6小时、32℃为4小时。7．ICSH、ICTH推荐使用3.2g/dl(含2112O)或0.109mmol/l的枸橼酸钠作为凝血因子检查的抗凝剂。另外，近年来，许多试验室采用缓冲抗凝剂，这种试剂对标本经冷冻保存后再行分析更为适宜。因为无缓冲剂，血浆pH值随时间而增加，凝固时间可延长，特别是Ⅷ因子即使是在-20℃保存，其凝血活性也可减少50%。缓冲剂的作用是维持血浆恒定pH，防止易变因子失活。血液与抗凝剂的比例必须相当精确，抗凝剂在血标本的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度，进而影响试验结果，一定要注意采血时血液与抗凝剂的比例。应指出，所谓血液与抗凝剂按9：1比例混合，实际上是指抗凝剂与正常压积血液的血浆之间的比例而言。因此应根据患者红细胞比例（Hct）状况随时高速抗凝剂用量。(二)仪器及试剂的选择的质量控制1．购置仪器后应按说明书标出的仪器应能达到的性能参数对仪器进行评价，发现问题及时与厂家联系。2．在检测过程中使用的加样器应进行校准，保证试剂稀释和加样量的准确。3．有定标血浆的检测项目，须用定标血浆建立标准曲线，在更换试剂批号或种类时均应用定标血浆重新建立标准曲线。4．试剂在预温槽内的放置时间应严格按试剂说明书的要求进行限定，放置时间延长会影响测定结果的准确性。5．鉴于目前凝血试验标准化工作还有待完善，不同检测系统（仪器、试剂、定标血浆、质控物）测出同一标本的结果有差异，为此在更换试剂种类甚至批号时有必要重新建立正常参考范围。6．最好是用与仪器厂家相同的品牌试剂。(三)凝血分析室内质量控制方式的选择及程序设计1.质控方式及设计过程质控方式：适合于血凝的质控有1〉Levy-Jeninings质控图2〉“即刻性”质控3〉Westgard多规则质控图为了获得优化的性能,质控方法必须具有尽可能低的假失控概率(Ｐｆｒ)和尽可能高的误差检出概率(Ｐｅｄ)。假失控概率和误差检出概率将依赖于质控规则和在分析批上质控测定值的个数(Ｎ)。1〉Levy-Jeninings质控图设计过程：通过以下步骤来确定质控范围。①最佳条件下的测定误差。最佳条件下已知值质控血清变异（optimalconditionsvariance,简称OCV）的测定在本实验室最佳条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清20-30次，测得结果计算，求出该组数据的均值和标准差（SD）表示该实验室的最佳工作质量。②已知值的血清在常规检验条件下的误差。常规条件下已知值质控血清变异（routineconditionsvariance-knownvalue,简称RCVK）的测定。做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重新进行RCVK的测定。如果RCVK的SD值更小，说明OCV不是最佳条件下测定的，应重新再测OCV。常规条件下，RCVK肯定要比OCV大。通过质控控制各项条件，使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结果，报告能否发出。③未知值的血清在常规检验条件下的误差。常规条件下,未知值质控血清变异(routineconditionsvariancl-unknownvalue简称RCVU)的测定，有时为了避免主观性,再作RCVU测定。测定步骤同RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。④临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差，失去质控的意义。⑤质控图通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据RCVK的和SD作质控框图。利用质控图可以对每次检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，该质控图可以连续作下去。质控血清的值低于-2SD的范围,属”告警”，应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。血凝试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，不是定论。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超过2SD应作为”告警”，二次超出2SD为”失控”。当质控过程中，出现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原因,此时，应重复进行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。一般认为：①一次超出3SD；②连续二次超出2SD；③3-5次连续处于一侧的2SD之内；④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。第③、④种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。省医院质控规则•⑴警告：质控项目检测值超出±2S。•⑵失控：质控项目检测值超出±3S，连续两次测定结果差值超出4S；同一天两水平质控同时超过2S。2〉统计学计算方法—“即刻性”质控法以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，“即刻法”的建立具体计算方法如下：1)先将测定值从小到大排列2)计算X和SD。3)计算SDI上限和SDI下限值。4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。当SDI上限值和SDI下限值＜n2SD时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI