GPC-净化系统

J2ScientificGPC凝胶渗透色谱操作指南应用部分在您阅读本指南之前，最好先熟悉仪器的操作，并已经掌握软件中文操作手册中的内容。本指南旨在帮助新用户掌握仪器的维护，方法建立及简单的故障排除，北京绿绵巨贸科贸有限公司对此指南保留全部权力，任何未经允许的复制、转载及其他以赢利为目的的商业行为均构成对本公司的侵权。凝胶渗透色谱原理简介Accuprep系统结构及工作框图注意事项如何建立适合我的应用的方法GPC柱的维护和重新装填如何备份数据常见故障分析凝胶渗透色谱原理简介凝胶渗透色谱，简称GPC，是一项比较传统的分离技术，GPC的柱子由化学惰性的中空小球组成，利用空间排阻的原理对样品进行分离，详见下图：由于小分子化合物会从填料的孔中穿过，而大分子从填料周围的空间穿过，会造成小分子与大分子之间的行程差距，这样大分子与小分子会先后从柱中馏出，起到分离的作用。由于这一分离技术不受样品极性的影响，所以对于色谱用户来说，是一种非常有效解决色谱柱不能分开的样品的手段，尤其是对于脂肪类，蛋白及色素类大分子干扰物，这些物质对于色谱柱，进样口来说非常危险，而在生物源样品当中的含量一般又比较高，那么在进行样品分析之前进行一步GPC净化就显得非常必要了。小分子通过填料“球”中的孔大分子不能从孔中通过Accuprep系统结构及工作框图AccuprerpTM是由美国J2Scientific公司生产的凝胶渗透样品净化系统，早在上世纪80年代就引入中国，目前其产品型号主要有手动AccuPrepJr和自动AccuPrep两种，在2005年该公司又推出了新型的AccuprerpTMMPS系统，体积进一步小型化，并能整合计算机及在线浓缩，SPE等多种技术，更加趋于成熟。由于目前大家采购这一仪器主要是为了提高效率，本指南将重点放在对自动仪器的介绍方面。一台完整的GPC系统包括几个部分：触摸屏，控制模块，输送泵，检测器，自动进样器和软件部分。让我们先来认识一下仪器各部分：AccuPrepMPS自动系统AccuprerpTM自动系统AccuprerpTM手动系统AccuPrepMPS+AccuVapGPC在线浓缩系统工作框图：详见附录1。收集架样品架柱子支架触摸屏输送泵检测器V1/V2阀柱切换阀进样环与进样阀注射泵自动进样器注意事项：1.样品在进样前必须经0.45u的微孔膜过滤。2.含水量大的样品在进样前须脱水。3.对于快速柱来说，脂肪耐受力为0.5克；传统柱为1克，那么在进样前请以此为根据来计算取样量。例如某种样品的脂肪含量为20%，那么称样量请不要大于2.5克。4.在完成前面的样品处理后，如液液萃取，要将样品体系转换成GPC所用的流动相，一般来说除石油醚外，其它基质如丙酮，必须进行这样的转换。而如果采用乙酸乙酯这类与水互溶的溶剂进行萃取，最好过无水硫酸钠脱水。如果样品溶剂无法进行转换，那么不同的溶剂总量不得大于进样量的10%。5.GPC柱要求流动相与柱子规格一致，请不要随意变更流动相的比例及组成。6.系统主要采用尼龙接头，在连接时适当拧紧即可，过度用力会造成螺纹损坏。7.PTFE的连接管比较脆，不可折成死弯，并在移动仪器时小心。8.严禁使用酸，碱性流动相，严禁使用水做为流动相，严禁使用缓冲盐。9.流动相最好每次配制的量够用，如果放置时间过长，最好重新配制。对于乙酸乙酯来说长时间放置会吸收水分，二氯甲烷见光分解后会产生盐酸，这些都非常不利于GPC分析。10.如果有其它不明事项，请咨询我公司工程师，请勿自行尝试。如何建立适用于自己的分析方法针对一般的农药/兽药残留分析来说，样品基质中的大分子干扰物主要为色素，脂肪及蛋白，多糖等生物源的干扰物。这类物质对于后面的色谱分析来说，是非常令人讨厌的，不但会带来噪音高，杂峰多，而且会污染色谱的进样口，离子源，并对色谱柱的寿命也会有很大影响。虽然还有其它方法进行净化，例如氧化铝柱，酸性硅胶柱等，但这类方法多数会对待测样品有不同程度对的吸咐，会引起回收率的问题。根据凝胶渗透色谱的原理，大分子干扰物会率先从柱子中流出，随后是小分子的目标化合物，那么对于一个GPC的方法来说，关键在于找出什么时间收集，什么时间停止收集。为了说明如何找到准确的收集时间，我们以50%乙酸乙酯/50%环已烷的GCP色谱柱对溴氢菊酯净化为例：1．移取2ml，100ppm的溴氢菊酯标准品（请用1：1乙酸乙酯：环已烷配制）到样品瓶，并加入1ml色拉油最后定容至10ml,做为我们的待分析样品。2．在软件中，编辑方法default.met,对于快速柱来说，第一个馏分设定30分钟不选择收集流速设定为4.7ml/min,2到5馏分都不进行设定选择记录检测器数据选择合适的柱子保存方法即可。3．编辑样品序列，待序列运行完毕后进入accuchrome,导入数据，根据标样的峰来设定收集时间，为了保证回收率，一般来说会让收集时间段略宽于峰宽。4．随后我们再回到Accuprep软件，新建一个方法，注意这里的时间不是保留时间，而是一个时间段，比如我们刚才运行的谱图中溴氢菊酯的出峰时间为10分钟到12.5分钟，则在这里我们设定馏份1的时间为10分钟并不收集，馏份2的收集时间为2.5分钟并收集，并修改为不记录检测器数据，最后保存方法,那么这个方法建立就完成了。5．但是通常来说，我们的分析不会这样简单，我们通常在一个分析中要应付多达20，乃至40到50种农药，那么我们如何建立一个方法来进行这样的净化呢？其实还是很简单，我们只要找到在这个样品列表中分子量最大和最小的化合物作为开始和结束收集的标志，在谱图上找到开始出峰和结束的时间就可以了。6．还有一类农药，在紫外检测器上并没有明显的吸收，我们如何来确定处理方法呢？一个是找一个分子量和结构相似，紫外有吸收的化合物来代替，由于GPC原理与样品的极性等化学活性无关，只与分子量大小有关，那么一般来说这样的方法完全可以找到准确的收集时间。那么还有一种方法就是进行分段收集。首先根据分子量信息可以大概知道待测样品会在什么时间馏出，然后将这一段时间分成几段，随后将分段收集后的样品上色谱分析，来判断其所在的位置。7．虽然我们很注意对柱子的清洗，但是还是难以保证会有些强极性的物质会留在柱子的填料中造成柱压升高，着色等现象，那么为了排除这些因素对保留时间的影响，对于我们已经确定好的方法，有必要在半年或一年后，进行方法的校准。GPC柱的维护与重新装填一根GPC柱如果维护好的话，那么样品重现性会更好，柱效会比较高，寿命也会更长。通常GPC柱处在流动相保护当中，但如果长时间停机，虽然我们有柱切换阀对柱子进行保护，一般来说柱子不会出现问题，但还是有报告柱子当中的流动相会跑掉造成柱子变干，那么此时如果开机后立刻用大流速平衡柱子，会造成柱内压力不匀，造成柱子损坏。那么此时需要先用2ml/min的小流速平衡10分钟，再使用常规流速，并注意观察柱压的变化，直到柱压稳定并在正常的8－12psi之间即可进行分析。一根柱在最初的使用当中，柱压一般在5－8psi,而12psi以下的柱压都可以视做正常，但要注意方法的校准。当柱压第一次超过12psi时，将柱子以0.5ml/min的流速反洗1小时可以起到一定的清洗作用，在反向清洗时，请将出口直接接到废液而不要再进入系统管线。如果反洗后压力仍然过高，则应将柱子重新装填。一般来说柱子重新装填建议采用全新的填料，当然也可以尝试将旧填料反复清洗后再装入，但寿命一般不会太久。柱子的重新装填：请确认以下零件齐备：1Frit,SS,20µm,GlassColumnFR506A2O-Ring,SiliconeEncapsulatedCO408A3BedSupportHolder,GlassColumnCO635A4SealTeflonCO422A5Plunger,Long,GlassColumnCO300A6Collar,GlassColumn,DelrinCO3057Cone,CompressionCO432A如果发现零件不全请立即与我公司联系订购事宜。装填步骤：1、在确定以上零件齐备的状态下，请准备以下必须的工具：铁架台，250ML烧杯两只，玻璃棒一只，吸管一只，适量的流动相，以及浸泡过夜的填料。2、将柱两端的四只螺母取下，就可以将两端的封套取下，将柱子的出入口的管线放置在烧杯中，用手握紧柱塞中部反时针将其旋松一圈至两圈即可，这时柱塞就可以从玻璃柱拨出。将两个柱塞全部取出后，向玻璃管中加适当流动相并用玻璃棒搅动原有的填料，将其取出。3、反复清洗玻璃管，直到玻璃管壁上不再粘有填料，将一个柱塞装好，把玻璃管垂直夹在铁架台上，装好柱塞的一端向下。4、将准备好的填料倒入玻璃管中，并用流动相冲洗烧杯和玻璃棒，及玻璃管内壁，待玻璃管内壁没有填料后，等待流动相距离柱床一厘米左右，将另一根柱塞装入，推至柱床处旋紧。在取出和装入柱塞时，请沿柱子轴向均匀用力，不要两其它方向摇晃以免损坏玻璃柱管。如发现CO422A已经损坏，请予以更换。5、重力装填的柱子在压力系统中需要重新调整。在当前柱床的两端做好记号，将柱子接入系统，2ML/min的流速下检查是否有泄漏，如发现有泄漏请重复2-4步骤。随后将流速逐渐加大至分析流速，待柱压稳定后检查柱床是否被压缩。在被压缩的位置做好标记，停泵，将柱子的一端与大气联通，旋松柱塞，调整柱床长度至刚才的标记即可。6、运行标准品与原来的谱图进行比对，如发现保留时间有所漂移，则需要重新调整方法。[溶剂的选择]所选用的溶剂应该对目标物有良好的溶解度，并对凝胶有一定的膨胀力，不能使每克凝胶的膨胀体积超过2.5ML的溶剂不能用于GPC，下表为用于Bio-BeadsS-X3的不同溶剂的膨胀因子：溶剂0.5小时后18小时后四氢呋喃(THF)5．455.45二氯甲烷-环已烷(1：1)5.355.35甲苯5.355.35二氯甲烷-已烷(1：1)4.854.85二氯甲烷-环已烷(15：85)4.354.40乙酸乙酯3.753.75环已烷2.002.65此部分内容引自中国疾病预防控制中心吴永宁老师的《色谱在食品安全分析中的应用》如何备份数据随着时间的推移，数据越来越多，尤其是在accuchorme软件里，导入的数据列表变得越来越长，找起数据来会非常困难。当然您可以用工厂提供的软件J2GPCBACKUPTOOL来进行数据备份并将其从列表中先移除。当数据很多时，可以用以下的办法来进行批量移除：1．关闭Accuchrome软件，并重启电脑。2．在C:\programfiles\microsoftSQLSever\MSSQL目录里，会发现一个目录“J2DATA”，将其重命名，如J2DATA2004。3．插入GPC软件光盘，重新安装“Setupdatatables”和“InstallDBUpdates1.01”。4．随后进入C:\programfiles\microsoftSQLSever\MSSQL，查看目录“J2DATA”是否已经被重新建立。如已经建立，则备份成功。5．再次打开Accuchrome软件，此时左边的数据栏已经清空。6．所有的.xml文件仍然存在于data目录，此时可以将其全部备份到别的计算机了。常见问题分析1．与计算机无法通讯a)在触摸屏的hardware页面中，切换成了touchscreencontrol。这样的设置是用触摸屏进行仪器控制，请切换成pccontrol，并重启控制模块即可。b)请检查软件设置中是否设置了与控制线相同的串口中，并检查计算机的串口是否工作正常。c)将控制模块的侧板打开，观察通讯板上电池旁边的红色LED是否亮起？如不亮，请检查其下方的保险管是否完好，检查主板上的电池是否仍然有电，正常电压为3V。d)在触摸屏进入hardware菜单，请要查看firmware版本是否显示正常，一般来说应为VCXXX/TPXXX,XXX代表数字，如果显示为？或其它字母，请与我公司工程师联系。2．我的收集瓶是空的请首先用软件检查V1/V2阀是否工作正常，并检查流动相是否足够。3．我的检测器得到了负峰a.请检查流动相是否用完。b.是否采用了其它的