蛋白质层析技术

蛋白质层析技术蛋白质层析介质蛋白质层析技术蛋白分离纯化平台及单抗的分离纯化蛋白质层析的原理和要点层析的概念流动相固定相C流出组份123123洗脱峰层析一般地是一种物理方法层析的热力学分析：分配;吸附等温线；吸附---脱附（解吸附，洗脱）；线性和非线性过程层析的动力学分析：塔板理论（板高方程）层析是最强有力的分离手段液相层析生化分离技术，基因工程技术和免疫学技术并称为生物技术（Biotechnology）液相层析是生物大分子分离纯化的最重要手段蛋白液相层析的应用已知和未知蛋白质的纯化o结构、动力学、药物作用靶点研究对高纯蛋白的需要o免疫学研究及酶免检测抗体抗原的制备o基因工程药物生产基因治疗对大量质粒的需要蛋白液相层析的构成分析型层析柱和制备型层析柱o分析层析：上样量在吸附等温线的前至中段的线性范围中，可以快速定量分析样品，建立纯化方法o制备层析：上样量在吸附等温线的中至后段的非线性范围中，不同组分间的相互作用不可忽略，大量纯化样品获得蛋白产物层析仪o蛋白分析和纯化实现的设备蛋白液相层析的一般程序样品处理选择分离机制建立初步纯化流程流程优化放大Polishing(精细纯化)样品制备一般性处理1.去处颗粒物——5µm、2µm、0.45µm分级过滤，0.2µm除菌2.蛋白样品的富集和浓缩3.脱气纯化过程中样品处理1.脱盐和缓冲液交换2.去污剂的去除3.离子污染物的去除4.其它的处理和浓缩分离纯化机制ChargedGroups(asp,glu,lys,arg,his)IonExchangeandChromatofocusingHydroxyapatiteElectrostaticCoordinationcomplexes-Repulsion-Geometricchargedistribution-SizeandShapeGelFiltrationBindingSiteBiospecificAffinityChromatographyHydrophobicRegion(phe,trp,ile,leu,val,gly,ala,tyr)HydrophobicInteractionChromatography(HIC)ThiolGroups(cys)CovalentChromatography蛋白质层析介质基体须具备的特性生物兼容性：亲水性，大孔径.不会使生物大分子失活，没有生物化学毒性：过强吸附，泄漏，氧化还原性化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的.pH,络合物,巯基化合物…必要的机械性能:流体中的耐压性结构:典型层析介质的放大观察下图:2%agarosegel白线段:500nm右图:SephacrylS-500右上:白线段10um右下:白线段0.5um化学组成:亲水多孔高聚物等天然高分子多糖:纤维素,交联葡聚糖,琼脂糖及共聚物----孔径分布宽,较软合成高聚物:聚丙烯酰氨类,聚丙烯酸脂类,聚乙二醇聚丙烯酸脂共聚物,亲水性处理的聚苯烯类无机化合物:硅胶,羟基磷灰石,氧化锆聚合物基体(matrix)孔的结构孔径分布:分配层析要求分布宽,均匀,相应于低交联度高交联度导致孔径分布偏向高,介质本身微观不均匀性变大,适合大孔径高硬度吸附层析孔的结构可分为三种类型标志产品:SepharoseHP，Toyopearl；MacroPrep，UNOSphere，SOURCE；UNOQ，POROS基体孔结构决定传质特点孔结构决定扩散速率：孔的开放性越大，扩散越快，对层析的流速越不敏感；反之亦反动态载量（DynamicCapacity）动态载量是制备层析的重要概念：层析过程是偏离平衡态的，流速越大，偏离越远，反之亦反动态载量是制备层析介质的重要性能指标，更快更高是人类活动的重要目标层析介质颗粒度与动态载量小颗粒传质更迅速，动态载量更高IgG1在不同颗粒度的Bio-Rad陶瓷性羟基磷灰石上的动态载量比较Buffer-0.05MMES,pH6.5;Flowrate:600cm/hr吸附动力学与动态载量长程作用（库仑力）比短程作用（疏水相互作用）受流速影响小些；粘度与动态栽量负相关从动态载量看上样条件BSA在阴离子交换介质上的动态载量：吸附量对洗脱剂的非线性：动态载量对洗脱剂强度远比对其洗脱体积敏感吸附蛋白的大小与动态载量层析介质表面吸附功能基团的密度大大超过实际用来吸附蛋白的量小分子对层析介质表面吸附功能基团的密度更加敏感柱效依赖于层析介质对样品的选择性和分离带宽.在多孔颗粒介质的柱子中带宽或柱效表示为：H=2d+B/V+Cmd2V+Csd2Vd=层析介质离子直径=填充不规则因子H=Plateheight塔板高度或柱效A=Eddydiffusion涡流扩散B=Longitudinalmoleculardiffusion径向扩散(可忽略)Cm=non-equilibriummasstransferinthemobilephase流动相非平衡物质转移Cs=non-equilibriummasstransferinthestationaryphase固定相非平衡物质转移（显著影响）V=Eluentvelocity洗脱速度影响分辨率的因素柱效(H)vs流速(V)HV(flowrate)eddydiffusionlongitudinaldiffusionNon-equilibriummasstransferResultingchromatographicbehavior塔板高度分辩率不同吸附机制的洗脱峰宽与流速BSA在同样尺寸层析柱,同样基质颗粒度,同样上样量结论:影响峰宽的因素还有---溶液粘度,洗脱动力学;在其它相同的情况下,离子交换层析比疏水层析的分辩率要高一些1)Thyroglobulin2)Gamma-globulin3)Beta-globulin4)CytochromeC50-100µmUNOsphere30-60µmMacro-Prep5020-40µmMacro-prep2510µmBio-ScaleUNO选用高分辨率预装柱进行分析和工艺优化，然后逐级放大分析–5-10µmbeads–1-20mlcolumns–Highoperatingpressures,(80psi)半制备–20-30µmbeads–20-500ml–Mediumoperatingpressures(30-100psi)制备型层析–40-200µmbeads–20ml-1000liters–Lowtomediumoperatingpressures(5-50psi)规模：分析还是制备？分离机制选用策略IEXHICHydroxyapatiteAffinitySECAmmoniumsulfateHICHydroxyapatiteAffinitySECHICHydroxyapatiteIEXAffinitySEC各种机制交替试用、相互衔接、补充分步洗脱还是梯度洗脱？几步完成纯化？综合考虑样品的各种性质ProductProperties–Stability–ChargeatdifferentpH–Hydrophobicity–MolecularSize–Essentialco-factorsFeedProperties‐Criticalimpurities‐Productconcentration‐IntroducedcontaminantsFinalProductspecifications–Purity–Costperunit–Lotsize设计合理的方案SeparationChemistryMethodScoutingChemicalStability(lifetime,hygiene)ProductivityPurity,FinalScale,EconomicsChromatographymediawithrequiredprocessperformanceBaseMatrixBeadSizeIgG样品中蛋白酶的降解作用目标产物IgG中残存蛋白酶的降解作用对pH有很强的依赖性蛋白酶作用量:用每克IgG中被消化的IgG的毫克数来表示阳离子交换与DNA污染某阳离子交换层析用于早期步骤分离一株小鼠IgM阴影为测得的IgM折线表示的DNA含量范围10exp6---10exp10同样的起始样品不同的纯化方案R:含目标IgM的起始粗提物方案A:两步离子交换最后一步低离子强度下分子排阻方案B:疏水层析,阴离子交换,最后高离子强度下分子排阻生物大分子液相层析仪蛋白质液相层析有其特殊性-生物相容性和化学稳定性对层析仪有与小分子物质液相层析不同的要求液相层析仪已是非常成熟的设备层析仪是实现蛋白分析纯化的场所液相层析仪的基本结构输液泵——注射泵输液泵——恒压泵输液泵——双柱塞泵不同泵的输液特性单柱塞泵输液脉冲性较大双柱塞泵，可实现均匀输送双柱塞二元梯度泵是最精密的输液装置液相层析仪的特性对于保留值相差较大的物质的分离，最有效的方法的是梯度洗脱蛋白质液相层析使用二元梯度所谓四元梯度，仅限于小分子化合物的分析二元梯度四元梯度层析仪的核心是输液泵双元梯度可实现高压混合为了保证重现性，液相层析仪使用恒流泵用于分析应保证0.01ml/min的流速精度和梯度精度，3000psi以上的高压40ml/min的流速可运行500ml的离子交换柱，纯化量可以达到克级更换泵头技术任何泵的流量范围都很有限更换泵头技术是扩大流量范围的最优性价比的方案该技术在Bio-RadDuoFlow蛋白层析仪上实现泵的消耗费用很低，只需更换密封垫圈F10F40单柱塞单泵低压混合——Waters650系列双柱塞单泵低压混合——BioCAD单柱塞双泵高压混合——Gilson，Beckman双柱塞双泵高压混合——HP,Bio-Rad,APBAKTA泵决定了层析仪的特性检测器蛋白质液相层析对检测器的要求较简单，多波长检测使用机会较少，而电导检测必不可少（2M(NH4)2SO4~230ms/cm）其它如pH检测器、折光检测器、荧光检测器、液质联用检测器的消耗费用是层析仪中最昂贵的（灯的更换、光栅的维护）目前常见的几种检测器三波长检测器电导检测器UV/PH/电导检测器AKTADuoFLow检测器UV检测器PH检测器四波长检测器高集成度的仪器有利于减少扩散，提高性能Model2110RediFracFrac200BioFracPerformancePerformanceGilson204PricePriceFrac100$1000.00USList分部收集器多种收集架可供选择BioFracFractionCollectorOptionalRack用各种阀提高自动化程度Make-before-break高压阀AVR7-3高压上样阀AVR9-8高压阀，溶液转向各种低压阀SV5-4低压阀，缓冲液选择SVT3-2低压阀，溶液选择或转向灵活应用各种阀和辅助泵构建随意层析系统软件功能——控制硬件、编程控制分析纯化过程、数据分析和管理、用户管理友好程度——直观、易学易用00:30:0000:40:0000:50:0001:00:00Hr:Min:Sec0.000.501.001.502.002.503.003.504.004.50AU-1.00-0.500.000.501.001.502.002.503.00AUTraceCompareOverlay几种蛋白层析仪的综合比较ListPricePerformance高集成、模块化、高灵活性是仪器先进性的体现和发展趋势有关蛋白层析仪的几种错误观念蛋白层析与HPLC(不锈钢材质，耐强有机溶剂，不耐酸，Cl-，EDTA等螯合离子，盐等蛋白纯化试剂）。层析柱或层析介质是层析分离实现的场所，现代蛋白液性层析仪兼容所有蛋白层析介质，不存在所谓“有利发挥介质特性的层析仪”。工艺移植和同一介质的不同粒度有关，一般和仪器无关，