第10章-层析分离技术与设备

第10章层析分离设备第1节层析分离概述引言层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。一、层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。二、层析法的分类按两相所处的状态分类：流动相有两种状态：*液体作为流动相*气体作为流动相固定相也有两种状态：*固体吸附剂作为固定相*以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分为：液相层析液-固层析液-液层析气相层析气-固层析气-液层析按层析过程的机理分类：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。亲和层析法：固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离。按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。三、层析法的基本概念1、固定相固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。2、流动相在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。3、分配系数及迁移率（或比移值）分配系数：在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。迁移率（或比移值）：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。相对迁移率：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。（常用）4、分辨率（或分离度）分辨率：相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。5、保留体积和保留时间保留时间(retentiontime，tR)：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积(retentionvolume，VR)：从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。第2节吸附层析技术一、基本原理吸附层析法（液-固色谱法，LSC）原理：利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。特点：适合分离不同种类的化合物(醇类和芳香烃）。吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离物质的极性官能团作用。常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等羟基羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2],最重要的用途是用于分离蛋白质与核酸。二、吸附剂第3节凝胶过滤层析一、基本原理概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。二、凝胶的种类和性质（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex)1、SephadexG——G后的数字为凝胶吸水值（ml/g）的10倍。——可用于分离蛋白质、核酸、酶、多糖、多肽、氨基酸、抗菌素，也可用于高分子物质样品的脱盐及测定蛋白质的相对分子质量。2、Sephacryl——葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联而成。——优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108——不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。（二）琼脂糖凝胶产品：Sepharose(瑞典)、Bio-gelA(美国)、Segavac(英国)机械强度和筛孔的稳定性均优于交联葡聚糖凝胶。琼脂糖浓度越大，网状结构越密集。排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。（三）聚丙烯酰胺商品名为Bio-GelP。由丙烯酰胺（acrylamide）与甲叉双丙烯酰胺交联而成。丙烯酰胺的浓度越高，交联度越大，孔隙度越小。主要用于蛋白质相对分子质量的测定、核苷及核苷酸的分离纯化。三、凝胶过滤层析的应用1、生物大分子物质的分离纯化2、分子量的测定3、分级分离4、溶液浓缩5、平衡常数的测定6、细胞及颗粒的分离第4节离子交换层析法1、离子交换剂：离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。2、交换原理：根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。一、基本原理X+RY-R-X+Y－+A－R-X+A－+Y－二、离子交换剂类型1、离子交换剂的基质（1）疏水性基质常用的有聚苯乙烯、聚丙烯酸型离子交换剂机械强度大、流速快，但具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变性。一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。（2）亲水性基质常见的有纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）等与水有较强的亲和力适合于分离蛋白质等大分子物质。2、离子交换剂的电荷基团（1）阳离子交换树脂——强酸性：磺酸基团(-R-SO3H)——中酸性：磷酸根(-PO3H2)、亚磷酸根(-PO2H2)——弱酸性：羧基(-COOH)、酚羟基(-OH)（2）阴离子交换树脂——强碱性：季胺盐[-N+(CH3)3]——中碱性：叔胺[-N(CH3)2]、仲胺(-NHCH3)、伯胺(-NH2)——弱碱性：伯胺(-NH2)、二乙基氨基乙基(DEAE)3、离子交换剂的形状纤维状、微粒状、珠状、无孔微球状、大孔微球状第5节亲和层析法1、概念亲和层析是利用待分离的生物大分子和它的特异性配体间具有的特异亲和力，使之与杂质成分分离的一类特殊层析技术。具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA、、糖蛋白-植物凝集素等。一、基本原理2、亲和层析的原理将具有亲和力的两个分子中的一个固定在以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混合组份的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出，然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。+CCC配基蛋白质1.配基固相化2.亲和吸附固体载体3.解吸附3、应用主要用于生物大分子（包括各种蛋白质、抗体、激素、维生素、核酸、病毒、细胞等）的分离、纯化。二、亲和层析介质1、基质（1）基质的类型与性质——常用的有：纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠（2）基质的活化①多糖基质的活化——溴化氰活化：溴化氰活化法是最常用的活化方法之一。含有伯氨基的配体，如氨基酸、蛋白质都可以结合在基质上。——环氧乙烷基活化：这类方法活化后的基质都含有环氧乙烷基，可以结合含有伯氨基（NH2）、羟基（OH）和硫醇基（SH）等基团的配体。②聚丙烯酰胺的活化：一般有以下三种方式：氨乙基化作用、肼解作用和碱解作用。③多孔玻璃珠的活化：通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺－玻璃（3）间隔臂分子①间隔臂的作用：将配体支撑到基质骨架外，减少空间位阻效应，增加配体对待分离的生物大分子的契合作用空间，提高契合效率。②间隔臂的长度：太短则效果不明显；太长则容易造成弯曲，反而降低吸附效率。一般C6~C8为宜。③方法：将适当长度的氨基化合物NH2(CH2)nR共价结合到活化的基质上。2、配体（1）配体的性质——配体与待分离的物质有适当的亲和力，能够可逆性结合。——配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性。——配体要能够与基质稳定的共价结合，配体自身应具有较好的稳定性。——合适的分子大小（2）配体与基质的偶联在适宜条件下，使配体上的活性基团与活化后的基质上的活性基团反应，使配体偶联在基质上。第6节层析分离设备及操作一、柱层析的基本装置1、系统组成液相供应单元、分离单元、监测单元、收集单元、控制单元2、液相供应单元（1）组成：泵、管路、阀门（2）泵常用蠕动泵要求：无死角、易拆洗、耐灭菌、脉冲小、耐腐蚀、运行稳定（3）阀门常用隔膜阀控制方式：电磁式、压缩空气式、手动控制3、分离单元——层析柱柱材料：不锈钢、玻璃、塑料、不锈钢衬塑料柱底板：20um孔径的筛网或筛板，支撑层析介质液流分配器：大规模生产用。减小进液脉冲，使液流均匀、平稳分散于整个柱床表面。4、监测单元（1）组成：检测器、流量计、感应器等（2）检测器常用紫外吸收检测器，其他还有荧光检测器、电导检测器、光密度检测器等。紫外吸收检测器用于监测蛋白质、多肽、核酸等成分的流出。电导检测器用于监测离子强度变化，以控制洗脱、清洗和平衡过程。二、柱层析的基本操作1、装柱（1）装柱要求均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。（2）选柱一般柱子的直径与长度比为1:10~50；凝胶柱可以选1:100~200，同时将柱子洗涤干净。（3）介质处理将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N~1N）、碱（0.5N~1N）、盐（0.5M~1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。（4）装柱操作关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm高的缓冲液，同时关闭出水口。大型柱通常配备自动装柱卸柱装置。2、平衡（1）作用使层析介质适应操作条件。（2）平衡操作柱子装好后，用恒流泵在恒定压力下以平衡缓冲液（有一定的pH和离子强度）走柱子，平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同。（3）平衡液体积一般为3~5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。3、原料处理及进料（1）原料处理原料液须澄清，调节粘稠度、浓度、离子强度等。澄清方法：微滤（1um以下）、离心（10000g）大规模生中有管路系统完成。（2）进料（上样）加样量：一般，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积。进料量由流量计和阀门控制。大规模生中通过转换平衡缓冲液阀门与进料阀门进料。4、洗脱洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。（1）简单洗脱概念：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。适用：被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长。（2）分步洗脱按照洗脱能力递增的顺序排列几种洗脱液，进行逐级洗脱。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。适用：混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离的场合。（3）梯度洗脱洗脱液的洗脱能力逐步连续增加。梯度可以