3.2动物细胞培养的基本方法

第五节动物细胞培养的基本方法一细胞分离1离心分离法用于从含有细胞的体液如血液、羊水、胸腹水中分离细胞。一般用800～1000rpm离心5～10min。2消化分离法先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞。常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰酶－柠檬酸盐、胰酶－EDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等。二细胞计数1血球计数板计数2自动细胞计数器计数3结晶紫染色细胞核计数法4MTT染色计数法三细胞传代1悬浮细胞的传代加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶即可。2贴壁细胞的传代①消化前需用肉眼或镜下观察需消化的细胞，确认细胞有无污染；②加入消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度；③消化时间不宜过久，一般在室温下静置2～5min,当见细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液。④终止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培养基。⑤已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过2～3次。⑥2倍体细胞培养时每次传代必须写上传代次数。⑦分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数细胞分种以20～30万个/ml,每次1传2或1传3。⑧传代后一般每天或隔一天换液，每3～5天就要传代一次。四细胞的冻存和复苏将细胞放入试管内，在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂（二甲基亚砜+山梨醇+甘油+蔗糖）。密封试管，继续在冰浴中停留15min。然后试管以1℃/min的速度冷却，降到-40℃，在-40℃停留2h后投入液氮罐（-196℃）。1细胞的冻存2细胞的复苏复温速率复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复苏速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温。第六节动物细胞大量培养的方法和操作方式动物细胞大规模培养：在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁依赖)等。已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。依细胞种类：原代培养、传代培养依培养基：液体培养、固体培养依培养器和方式:静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养。生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。一、动物细胞大规模培养的方法1、悬浮培养（suspensionculture）让细胞自由的悬浮于培养基内进行生长繁殖。适用细胞类型：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤设备：通气搅拌式生物反应器、气升式生物反应器。生产药物：单克隆抗体；干扰素。缺点：细胞体积小，且处于悬浮状态，难采用灌流培养，细胞密度低。优点：操作简单，培养条件均一，传质和传氧效果好，容易大规模培养。借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。2、贴壁培养必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用细胞类型：贴壁依赖型细胞，兼性贴壁细胞。基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具有一定电荷密度。优点：a容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。b容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度的目的，因细胞被固定，不需过滤系统。c当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。缺点：a操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积。b培养条件不易均一，传质和传氧效果差。c不能有效地监控细胞的生长。贴壁培养系统：中空纤维；玻璃珠；微载体培养。贴壁培养和悬浮培养的不同之处是在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上消化下来。3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养将悬浮培养和贴壁培养相结合的方法。①微载体培养：细胞贴附在载体表面。创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖；载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。载体：葡聚糖、聚苯乙烯、胶原等。理想的微载体应具备：生物相容性；无毒性；表面惰性；比重适当（1.030-1.045g/ml）；粒径均一，在60-250m之间（溶胀后）；光学透明；柔软；耐高压灭菌温度；反复多次使用；制备简单、原料充分。80年代以后发展的多孔微载体或多孔微球，增大了供细胞贴附的比表面积。应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原②包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。可用于包埋细胞的载体材料为：人工合成的高分子聚合物；糖类如纤维素等；蛋白质如胶原、纤维蛋白等。包埋法：将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法。优点：步骤简单，条件温和，负荷量大，细胞泄露少，抗机械剪切。包埋法缺点：扩散限制，并非所有的细胞处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定。常用的载体：琼脂糖；海藻酸钙凝胶微囊法：用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，细胞不能溢出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜。囊内是微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。③结团培养：利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本。二、动物细胞培养的操作方式1、分批式操作将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。2、半连续式操作当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用，它的优点是操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。3、灌流式操作当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。细胞被固定，在取出部分条件培养基和补充新鲜培养基时，细胞基本上都被保留在反应器内。第六节动物细胞生物反应器一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构1、搅拌式生物反应器2、气升式生物反应器3、中空纤维式生物反应器4、透析袋或膜式生物反应器5、固定床或流化床式生物反应器机械搅拌式生物反应器（1）罐体的高径比一般采用1-1.5：1，利于增大与空气的接触面（2）为防止搅拌产生的切力损伤细胞，搅拌速度慢，一般在20-100r/min（3）采用无气泡通气系统，防止气泡破裂时产生的应力对细胞的损伤（4）高密度、长时间培养以及提高反应器的生产效率考虑，反应器常常需要配备有进出液体系统，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离使细胞保留在反应器内的装置。气升式生物反应器与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，由于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的密封，降低了造价。高径比一般在10：1左右。中空纤维反应器由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50-100m，呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为200m，两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。•①不能重复使用；②不能耐受高压灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌；③难以取样检测。膜式生物反应器在动物细胞培养过程中，会产生一些代谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产物的产生会产生抑制作用，因此有些学者设计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分离开。结构较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，有实心载体和有孔载体两类。WaveBioreactor二、动物细胞生物反应器的检测控制系统1、培养过程需检测的物化参数直接在线检出取样离线检测检测后计算2、主要参数的检测和控制方法2、主要参数的检测和控制方法①温度②pHa在培养初期，偏碱，控制进二氧化碳量b当细胞密度提高后控制NaHCO3的量③溶氧④搅拌⑤进出液流量第七节动物细胞制药的前景与展望一、提高产量、降低成本和改进质量方面的研究二、转基因动物的研究三、组织工程的研究一、提高产量、降低成本和改进质量方面的研究为了提高产量，要提高细胞表达水平。为降低成本，须改进培养基配方。为改进产品质量，关键是糖基化质量。改进工艺，生产设备等二、转基因动物的研究转基因动物：通过实验方法，人工地把人们想要研究的动物或人类基因，或者是有经济价值的药物蛋白质基因，通常称为外源基因，导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。1动物血液生物反应器外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。大家畜的血液容量较大，利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。2动物膀胱生物反应器外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器,叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入5′端调控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。3动物乳腺生物反应器动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物,指导外源基因在乳腺中表达,并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。牛、羊的乳中蛋白质大多为酪蛋白、β-乳清蛋白、酸性蛋白、表达时需由特定的启动子调节分泌出来，该启动子定位在乳腺细胞中。现将该启动子克隆出来用于转基因动物中。在山羊奶中生产ATT显微注射仪示意图自1982年Palimiter提出用转基因动物来生产药用蛋白以来，发展迅速。优点：产量高成本低，质量与天然一样。缺点：外源基因与动物本身的基因组整合率低，外源基因应有的性质得不到充分表现或不表现。实验运动如牛、羊和猪的整合率一般为1%左右。外源基因对动物本身也有影响，它影响了动物的健康。三、组织工程的研究组织工程：通过对大量细胞的培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血管、人造骨等并用于临床治疗。•3.2动物细胞形态和生理特点•3.3生产用动物细胞的要求和获得•3.4动物细胞的培养条件和培养基•3.5动物细胞培养方法和操作方式•3.6动物细胞生物反应器及其检测控制系统•3.7动物细胞制药的前景和展望一章回顾1、离体培养的动物细胞分为那些类型及各自特点.2、生产用的动物细胞的种类及特点？3、常用的培养动物细胞的培养基的种类？4、如何进行动物细胞的大规模培养？5、动物细胞生物反应器有哪些类型？特点是什么？6、动物细胞制药有哪些新进展？7、动物细胞的培养剂为什么加入小牛血清？7、请举一例说明转基因动物生产药物的方法8、生产类淋巴细胞干扰素的细胞是来自淋巴瘤患者，药物经人服用会致癌吗？请分析原因。对其质量有什么要求？1、离体培养的动物细胞分为那几类（）（）（）2、真核基因