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实验三、细胞的传代与冻存1.细胞培养中为什么添加血清？2.使用血清需注意哪些方面？3.消化液胰酶的浓度是多少？4.使用小滤器过滤要注意哪些？针头滤器使用应注意的问题1.拧紧滤器2.注射器吸液体3.注射器插好滤器4.对着烧杯慢推压针芯看是否漏5.如不漏对小瓶过滤。6.滤器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体，反复多次，滤完。7.检查滤器滤膜是否完好。一、实验原理细胞贴壁过程培养细胞一代生长过程什么时候传代？细胞消化的最佳程度细胞冻存要求冻存条件操作要点二、实验目的掌握无菌操作技术。掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。掌握培养细胞的消化方法。了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。三、实验材料及设备1.细胞人宫颈癌HeLa细胞人胃癌BGC-823细胞2.试剂胰酶、DMEM培养基、血清、DMSO、抗生素3.仪器超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜4.其它用品：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯四、实验步骤1.准备：超净工作台紫外线处理30分钟,用肥皂洗手,穿鞋套，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置室温下预热。3．关闭超净台紫外灯,打开可见光灯开关,打开抽风机清洁空气，除去臭氧。用75%酒精擦双手消毒。4.正确摆放超净台内的实验用品：酒精灯、酒精棉球、新洁尔灭纱布、试管架、滴管筒（头）、吸管筒（头）、废液缸等。点燃酒精灯，准备好实验试剂：DMEM培养基（其中血清含量10%）、血清、胰酶等。5.点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。6.将培养用液（90mL)瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。7.打开血清（10.5mL)瓶，瓶口过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。8.无菌吸取10mL血清加入到培养液（90mL)中，用微量移液器加入双抗100μL轻轻混匀，配置完全培养基。9.在血清中（剩余0.5mL)加入4mL完全培养基轻轻混匀，加入0.5mLDMSO（冻存保护剂），轻轻混匀即为冻存液。10.细胞瓶口靠近火焰打开瓶盖并在酒精灯上烧口消毒，倒掉或吸出培养基（对于小口的培养瓶可采用倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出）11.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，弃胰酶，再加入一滴管或两滴管胰酶（以盖住细胞量为准，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，盖好瓶盖。12.显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、一半变圆，细胞边界清晰时，即可立起或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃胰酶13.加两滴管（约1.8-2mL）冻存液既全面吹打细胞瓶壁,吹打均匀，细胞浓度宜大，3×106个/mL左右。14.将细胞悬液吸至冻存管中，拧好盖，封好胶布，并标记好细胞种类，冻存时间，保存条件以及冻存者姓名等（悬浮细胞冻存将细胞离心后再加冻存液）15.在培养瓶(残余少量细胞）中加入5mL完全培养及，盖好瓶盖（拧紧后并旋回半圈）。做好记录，倒置相差显微镜下观察细胞的形态，放入CO2培养箱培养。16.冻存管在4度以下存放30min，转放到－20度1.5－2h，再转到－70度4－12h后即可转移到液氮内，注意做好冻存记录。把握好传代时机，80-90%汇合度阶段最好，过早细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳消化时间要适度，过短细胞不易脱落，过长细胞可脱落流失。消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。不同细胞对消化反应不同。贴壁不牢—直接吹下—细胞损伤注意事项1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤?2.细胞胞传代培养的目的是什么?3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同?4.如何估计是否传代和传代的方式?5.细胞冻存应注意的问题。思考题