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基因工程概念基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术定向改造生物啦！1、基因工程又叫做_______或__________。基因工程相关要点基因拼接技术DNA重组技术2、基本工具：“分子手术刀”:“分子缝合针”:基因进入受体细胞的载体:3、基本操作步骤：运载体DNA连接酶限制性核酸内切酶1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建（核心）3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平新生物类型、生物产品剪切→拼接→导入→表达基因重组黏性末端黏性末端1.限制性核酸内切酶一种限制性内切酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（切割DNA分子）来源：主要从原核细胞分离作用：作用结果：EcoRI重难点剖析:基因工程的“专用工具”形成平未端（SmaI）及黏性未端（EcoRI）1)、种类：2)、作用部位：E·coliDNA连接酶（黏性末端）T4DNA连接酶（黏性末端和平末端）磷酸二酯键DNA连接酶可把平未端或黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来，这样一个重组DNA分子就形成了。2.DNA连接酶——“分子缝合针”3.分子运载车——运载体（1）作用：将目的基因送入受体细胞（2）具备的条件：a.能自我复制.b.具有一个或多个酶切位点.c.有标记基因.d.对受体细胞无害.质粒、噬菌体、动植物病毒（3）种类：质粒——细菌拟核DNA之外结构简单、能自主复制的很小的环状DNA分子。小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶运载工具具备的条件结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个或多个限制酶切位点具标记基因质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒（一）目的基因的提取目的基因：主要是指___________________。获取方法：1、____________中获取目的基因2、人工合成法：化学方法合成DNA片段（反转录法、直接合成法）3、PCR反应扩增DNA基本操作步骤从基因文库编码蛋白质的结构基因原理：DNA复制过程：加热DNA解链冷却引物结合到互补DNA链互补链合成条件：耐高温DNA聚合酶基因文库的构建：提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库某种生物的mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库逆转录（二）基因表达载体构建1、基因表达载体由________、________________、_____四部分组成。目的基因启动子标记基因终止子2、启动子作用：3、标记基因的作用：RNA聚合酶识别和结合的位点，启动转录的“开关”。鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从普通细胞中筛选出含目的基因的受体细胞（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）用_______________切断目的基因，使其产生____________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶重组质粒形成过程:导入植物细胞：（三）将目的基因导入受体细胞导入动物细胞：导入微生物细胞：受体细胞导入方法体细胞受精卵受精卵显微注射法Ca2＋处理法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法将目的基因导入微生物细胞原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，故早期常作为受体细胞。大肠杆菌细胞用Ca2+处理感受态细胞重组表达载体DNA溶于缓冲液混合导入目的基因是否插入转基因生物染色体的DNA上（四）目的基因的检测与鉴定目的基因是否表达：目的基因是否转录：方法:DNA分子杂交方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交鉴定——抗虫性鉴定、抗病性鉴定、生物活性鉴定等（生理、性状水平的检测）检测转基因生物转基因生物是指利用技术导入培育出的能够将新性状稳定地给后代的生物。基因工程外源基因遗传基因工程优点：打破了常规育种难以突破的，的改变了生物的遗传性状.物种之间的界限(生殖隔离)定向1.抗虫转基因植物（一）植物基因工程硕果累累:2.抗病转基因生物3.抗逆转基因作物基因工程的应用4.利用转基因改良植物的品质方法:利用转基因动物生产药物--动物乳腺生物反应器获取目的基因（药用蛋白基因）构建基因表达载体（在药用蛋白基因前加乳腺蛋白基因的启动子）显微注射导入哺乳动物受精卵中形成早期胚胎将胚胎送入母体动物发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物个体中，转入的基因才能表达）（二）动物基因工程前景广阔:用转基因动物作器官移植的供体供体动物：存在的难题：解决方法：猪免疫排斥将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。（三）、基因工程药品异军突起:工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。我国已生产的产品：白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗等（四）基因诊断与基因治疗:基因诊断：用放射性同位素等标记的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞基因治疗：把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。体外基因治疗体内基因治疗基因治疗的类型比较：基因工程和蛋白质工程基因工程蛋白质工程相同点都要改造基因，都属于分子水平产生新的基因型，无新基因基因（型）产生的蛋白质原有的可以是新的联系蛋白质工程是以基因工程为基础，是基因工程的应用和延伸；前者可为后者修饰、改造酶蛋白质工程流程图1.从预期的蛋白质功能出发2.设计预期的蛋白质结构3.推测应有的氨基酸序列4.找到相应的脱氧核苷酸序列(即基因)板书：用干扰素例子，反推过程。第4步后接着做什么？基因DNAmRNA氨基酸序列多肽链蛋白质三维结构转录翻译折叠生物功能预期功能分子设计DNA合成以中心法则为原理和线索蛋白质工程专题二、细胞工程1、概念:应用的原理和方法研究的水平研究的目的细胞生物学和分子生物学细胞整体水平或细胞器水平按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品2、分类植物细胞工程动物细胞工程微生物工程（略）所采用技术的理论基础植物细胞工程通常采用的技术手段植物组织培养植物体细胞杂交植物细胞的全能性一、植物细胞工程(离体的植物器官、组织或细胞)脱分化再分化愈伤组织根、芽（胚状体）植物体培养条件：离体、含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适合的光照等外植体举例：花药离体培养；基因工程培育的抗棉铃虫的棉花植株；细胞工程中培育的“番茄-马铃薯”杂种植株等。1、植物组织培养扩大培养植物A细胞植物B细胞加酶去壁原生质体A原生质体B原生质体融合融合细胞再生壁杂种细胞脱分化去壁的常用方法：酶解法（纤维素酶、果胶酶等）诱导原生质体融合方法：物理方法：离心、振动、电刺激等化学方法：聚乙二醇（PEG）融合成功的标志人工诱导筛选愈伤组织杂种植株再分化2、植物体细胞杂交的过程（1）植物繁殖的新途径（见资料）1）微型繁殖（快速繁殖）2）作物脱毒3）神奇的人工种子（2）作物新品种的培育1）单倍体育种2）突变体的利用3）转基因植物的培育（3）细胞产物的工厂化生产3、植物细胞工程的实际应用二、动物细胞工程植物细胞工程常用的技术手段：植物组织培养、植物体细胞杂交等强调：是其他动物细胞工程技术的基础。动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合单克隆抗体制备等动物细胞培养技术回顾：常用的技术手段：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液去掉组织间蛋白10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养部分细胞遗传物质改变动物细胞培养不能最终培养成动物体随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖1.动物细胞培养:植物组织培养和动物细胞培养的比较项目培养基结果应用植物组织培养动物细胞培养均需适宜的外界条件：PH,温度,营养及“无菌、无毒环境”等（见资料）。固体、营养物质、蔗糖、植物激素培养成植株液体、营养物质、葡萄糖、动物血清培育成细胞系或细胞株1.生产蛋白质制品（如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体、动物激素）2.用于某些器官移植1.试管苗的快速繁殖2.无病毒植物的培育3.生产药物等4.人工种子（见资料）5.转基因植物的培育细胞A细胞B杂种细胞物理法、化学法灭活的仙台病毒2、动物细胞融合过程诱导动物细胞融合与植物原生质体融合的原理和方法是否基本相同？制备单克隆抗体：不具有繁殖性但具有抗原性获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）生物：灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（PEG）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较主要用于制备单克隆抗体卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞3.核移植与克隆动物：动物细胞核有全能性抗原动物体内刺激效应B抗体特点：产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏4、单克隆抗体1、常规抗体制备：一个B淋巴细胞：只分泌一种特异性抗体2、单克隆抗体制备：杂交瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞：能无限增殖融合单克隆抗体培养抗原注入小鼠体内已免疫的B淋巴细胞骨髓瘤细胞筛选出杂交瘤细胞筛选出能产生特异性抗体的细胞群体外培养体内培养从培养液中提取从小鼠腹水中提取单克隆抗体细胞融合动物细胞培养单克隆抗体的制备(特定的选择培养基)•主要用于疾病的诊断、治疗和预防。•若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。•特点：与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高、化学性质单一的优点。单克隆抗体的应用：单克隆抗体是指：杂交瘤细胞产生的单一抗体例．(06江苏)下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。（1）_______________技术是单克隆抗体技术的基础。（2）根据培养基的用途分类，图中HAT培养基属于________培养基。（3）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是________________。（4）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用________________。（5）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的_______________特点，又具备淋巴细胞的_______________特点。（6）淋巴细胞是由动物体_________中的______________细胞分化、发育而来。（7）杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是____________。动物细胞培养选择特异性强,灵敏度高灭活的病毒在体外大量增殖分泌特异性抗体骨髓造血干细胞主动运输6、基因型为AaBb的水稻(具有24条染色体)的花粉通过无菌操作，接入试管后，在一定条件下形成试管苗的育种过程。(1)愈伤组织是花粉细胞不断分裂后的形成的不规则细胞团，愈伤组织形成中，必须从培养基中获得__________。(2)要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有______和_______两类激素。(3)愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是_____________利用光照制造有机物，供试管苗生长。(4)试管苗的细胞核中含有___________条脱氧核苷酸链。(5