DNA分子标记

第八章DNA分子标记►遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，它一般具有较强的多态性、表现的共显性、不影响重要的农艺性状和经济方便、易于观察记载等优点。随着遗传学的发展，遗传标记也不断发展着，从描述生物外部特性特征的传统形态标记（MorphologicalMarkers），到研究染色体核型和带型的细胞标记（CytologicalMarkers）、生物生化特性特征的生化标记（BiochemicalMarkers）以及能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段的DNA分子标记（MolecularMarkers）。►前三种标记都是基因表达的结果，是对基因的间接反映，标记数目有限，多态性较差，易受环境的影响，不能满足种质资源鉴定和育种工作的进行。而DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是DNA水平遗传变异的直接反映，它具有不受生育期、环境和基因表达与否的限制，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定的特点。►近年来，由于DNA分子标记以其独特的优越性得到了迅速发展，已成为绘制指纹图谱，鉴别品种、品系（含杂交亲本、自交系）的有力工具。农作物育种、品种鉴定随着分子标记技术的日趋成熟及其在植物的指纹分析、资源检测、基因定位、遗传图谱的绘制等方面的广泛应用和深入的研究得到了发展。►与传统的遗传标记相比而言，分子标记具有多方面优点：（1）直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；（2）数量极多，遍及整个基因组；（3）多态性高，自然存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；（4）表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；（5）许多分子标记表现为共显性（Codominance），能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息。►分子标记技术为种质资源保护提供了有力的工具，借助于分子标记，通过物种分子遗传图谱的构建，群体遗传结构和多样性分析、物种演化和亲缘关系研究，能够对不同物种进行精确的系统学间的区分，精确确定物种的进化途径和分类地位，进而对现有品种的分子遗传图谱作图，能够最大限度地综合利用有利基因和淘汰不利基因，设计出最佳杂交组合；通过连锁标记的追踪和对数量性状(Quantitativetraitloci，QTL)的拆分，可准确定位一些其它方法难以确定的目标性状，从而进行早期选择，大大减少了世代间隔和育种的盲目性，而且不受植株发育阶段和外界环境条件的限制。►分子标记技术是建立于DNA水平的标记技术，可为农业研究中的性状选择、品种改良、资源分析、种及种源的鉴别提供稳定、准确的分子标记。可克服形态、生化、细胞等遗传标记作为辅助选择和鉴定中遇到的许多难以解决的疑难。目前，DNA分子标记技术已广泛地用于生物多样性的分析、种质资源的分类演化、遗传图谱的构建、基因的分离测序、作物品种及纯度的鉴定和杂交育种等许多方面，并显示了独到的优势。分子标记虽处于起步阶段，存在一定的局限性，但其准确、可靠、高效率等优越性在实践中已充分表现出来，展现出巨大的应用潜力和前景。1分子标记的种类及发展1.1RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段长度多态性）►RFLP是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的大分子片段的大小差异。这一标记系统是Bostein和White等于1980年首次提出的，也是最早的分子标记。其原理是生物在长期进化的过程中，会在种、属甚至品种间同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点上形成差异，或者由于点突变、重组等原因，引起限制性内切酶位点上核苷酸的替换、插入或缺失等变化，而引起DNA线性分子某一特定内切酶的识别位点发生变化。►因此，植物DNA经适当的限制性内切酶切割形成不同长度的片段，由于迁移率不同，便会在凝胶上形成连续的谱带模型，用同位素（通常用35S、32P和33P）或非同位素（如地高辛等）标记DNA作为探针，与转移于支持膜上的基因组DNA（限制性内切酶消化）进行Southern杂交，然后用放射自显影检测不同遗传位点等位变异（多态性），从而获得与探针同源的酶切片段的多态性图谱，即为RFLP。►但是，由于RFLP标记对DNA的需要量较大（5～10µg）,需要的仪器设备较多，技术也较为复杂，周期长。特别是在只需要检测少数几个探针时成本较高，另外检测中使用同位素（目前也有非同位素如地高辛，但价格高，成功率低），因而目前尚难直接用于育种。为解决这一问题，Talbert等（1995）提出将RFLP标记转化成共显性的PCR标记，以便在育种上加以利用。1.2RAPD（RandomAmplifiedPolymorphismDNA，随机扩增多态DNA）►RAPD是1990年由Williams和Welsh发明的分子标记技术。它是以基因组DNA为模板，以一个随机的寡聚核甘酸序列（常为10mer）作引物，通过PCR扩增，产生不连续的DNA产物，用以检测DNA序列的多态性。其原理是建立在聚合酶链式反应PCR（PolymeraseChainReaction）扩增基础上的，利用随机合成的寡聚核苷酸序列为引物，分别与DNA的两条单链结合，在DNA聚合酶的作用下，对植物基因组的特点区域进行PCR扩增。►其生物学基础是在引物结合序列上发生单个碱基突变、缺失、重复、易位、插入，从而改变了扩增片段的大小或无法扩增，形成多态性的DNA片段，因此存在大量的RAPD标记。RAPD以Mendel方式稳定遗传为显性表达，F2代呈3:1分离，不能将显性纯合体和杂合体（AA或Aa）分开。这样在选育过程中可能要进行F3及以后世代的样品分析。RAPD具有以下的优点：简单易行，DNA用量极少（15～25ng），无放射性，设备简单，周期短。因此，RAPD广泛地应用于群体遗传学中种属分类鉴定，动植物遗传连锁图的构建，基因定位和分离、基因的体外扩增以及杂交后导入基因的追踪等方面。►但是RAPD多数位点标记为显性，不能提供完整的遗传信息；结果稳定性较差。解决这一问题的办法有两个：(1)严格控制模板DNA和Mg2+浓度，保证反应条件的一致性。（2）将RAPD作为初步筛选鉴定的一种方法，所需DNA用等位特异性PCR（AS-PCR）或特殊序列扩增（SCAR）的方法，将RAPD转变成经典的PCR方法。另外，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显掩饰作用而使计算位点间遗传距离的准确性降低。3SSR（SimpleSequenceRepeat,简单序列重复）►SSR又叫微卫星重复序列(MicrosatelliteRepeats)，是由Zietkiewicz等建立的一种新型的分子标记技术。已经证明，真核生物的基因组中散布着大量的SSR，它们具有丰富的多态性，并能按Mendel方式稳定地遗传和分离。在人类和动植物的基因组中，均存在着许多由1~6个碱基对组成的简单重复序列，如：(GA)n、(AC)n、(GAA)n（其中n为重复次数）等。同一类的SSR可分布于整个基因组的不同位置上，每个座位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。►在植物中，Akkaya等(1992)发现AT重复较AC重复更为普遍。在人类基因组中，这些重复序列分别遍及所有的染色体及染色体的各个区段，在植物上也很可能如此。在人类基因组中，这些重复序列分别遍及所有的染色体及染色体的各个区段，在植物上也很可能如此。SSR检测的多态性频率比RFLP高很多，Gregan等在96份大豆资源中，发现多达29个SSR等位变异，而RFLP仅能发现2~3个变异。►SSR除用作探针外，还可以通过PCR扩增植物基因组中所含的重复序列区域，因此它具有PCR方法的优点：共显性标记，具有特种特异性。另外，其最大的优点为发现的标记引物可以共用；而缺点是必须依赖每类微卫星两端序列测序设计引物，而不像RAPD引物是随机合成的，且产生这样的引物非常费时，耗资。要克隆足够数量的SSR，并对其进行测序和设计引物，没有足够的投资、人力和时间，不可能实现。4SCAR（SequenceCharacterizedAmplifiedRegion，序列特异性扩增区域）►SAP(SpecificAmplifiedpolymorphism，特异性扩增长度多态性)，它是在RAPD和RFLP分析中找到多态性DNA片段回收克隆后对其两端测序，然后设计出较长核甘酸序列（如24碱基）的引物，进行特异性PCR扩增检测多态性，这种标记方法又称为序列特异性扩增区域（SCAR）[34]。SCAR在不同个体间可能表现为存在、缺失，为显性标记，也可能表现为扩增片段长度的差异，为共显性标记。利用SCAR标记可以解决RAPD标记中PCR扩增片段多，不易分析结果及重复的缺点。由于它可以使不同材料中的DNA差异通过单一带的出现与否而加以评判，因而是最适于辅助选育应用的分子标记技术。1.5AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,扩增片段长度多态性）►AFLP是荷兰科学家Zabeau和Vos于1992年建立起来的一种检测DNA多态性的新方法。由于它重要的实用价值，一出现就被Keygene公司以专利的形式买下。由于AFLP有其独特的优越性，得到迅速的传播，世界上很多实验室都在探索在各自研究中应用AFLP。因此，Zabeau和Vos不得不将其专利解密，并以论文的形式正式发表。AFLP技术的原理：►AFLP原理是基于PCR技术选择性扩增基因组DNA限制性酶切片段。其基本流程包括三个步骤：1.基因组DNA用限制性内切酶酶切后，与特定的AFLP寡聚核苷酸接头（Adaptor）连接，形成一个带接头的特异片段。限制性酶切片段用两种酶切割产生，一种是切割位点少的识别位点，是6个碱基的内切酶，如EcoRI.；一种是切割位点多的识别位点，是4个碱基的内切酶，如MseI。2.通过接头序列和邻近的限制性酶切位点序列作为引物结合位点，以引物3’端的识别进行PCR选择性扩增限制性酶切片段，可使目的序列扩增至0.5～1µg。3.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过放射自显影、荧光标记或核酸银染检测。AFLP技术的特点：►AFLP检测的多态性是酶切位点的变化或是酶切片段间DNA序列的插入与缺失，本质与RFLP一致。RFLP要采用Southern杂交方法识别大小不同的限制性酶切片段，从而揭示DNA的多态性。而AFLP要比RFLP简单得多，将RAPD的随机性与专一性引物扩增巧妙结合，而且可以通过控制引物随机核苷酸的种类和数目来选择扩增不同的DNA片段和数目。此外，还可以选用不同的内切酶以达到选择的目的。►由于AFLP综合了RFLP和RAPD的优点，既具有RFLP的稳定性，具有PCR反应快速、灵敏的特点，也具有RAPD的方便性，同时还克服了RFLP和RAPD的缺点。由于AFLP标记多态性强，结果稳定，重复性好，被认为是迄今为止最有效的分子标记方法。不管所研究的基因组DNA多么复杂，理论上讲，用AFLP方法都可以检测出任何DNA之间的多态性。AFLP具有以下特点：1)AFLP标记的检测不受环境、季节和时间以及组织部位和发育阶段的影响。可以用它在植株的早期鉴定和预测。2)AFLP可以对无任何分子生物学研究基础的物种进行研究，不需要知道基因组DNA的序列就可构建其指纹图谱。因此，AFLP适合于研究任何生物。3)AFLP所需DNA用量少、反应灵敏、快速高效，适合于大规模样品的研究。一个0.5mg的DNA样品就可以做约4,000个反应。4)AFLP指纹图谱多态性丰富，每个样品每次扩增反应可产生50～150条带，用最少量的引物就能获得最多的标记。5)绝大部分为显性标记，但也有一小部分为共显性标记，能检测整个基因组的遗传变异。6)由于带型清晰和相对较低的背景影响，具有高分辨能力；7)带型稳定，重复性好，结果可靠。这是因为AFLP采用了与接头序列和限制性内切酶识别序列同源的特异引物，而且在最初的几个循环中用了较高的退火温度，抑制了