菌落的PCR鉴定

实验六菌落的PCR鉴定【实验目的】通过本实验学习菌落PCR的基本原理与实验技术。【实验原理】重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落PCR方法对重组子进一步进行快速鉴定。以重组质粒作为PCR扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。【实验步骤】用200μL的黄色枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15μL无菌水中，吹打混匀，从中取2μL菌液作为菌落PCR模板。1．在200μlPCR管内配制20μl反应体系：反应物体积/μL模板DNA2.0灭菌蒸馏水（ddH2O)10.310×PCR缓冲液2.0dNTP（2.5mM）1.6引物1（2μM）2.0引物2（2μM）2.0rTaq酶（1.0单位）0.1Total202.将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000rpm离心15sec使反应成分集于管底。3.PCR反应热循环程序设置：①94℃预变性3min;②94℃变性30sec;③64℃退火30sec;30cycles④72℃延伸1min;⑤72℃延伸3min;⑥16℃pause反应结束后短暂离心，置4℃保存备用。配制1％的琼脂糖凝胶。4.取5μLPCR产物加1μL6×loadingbuffer于1%的琼脂糖凝进行电泳剩余的13μL菌液置4℃保存备用。【结果与分析】本实验扩增片段长652bp。由图可知，1、4泳道没有条带，说明目的基因没转入感受态细胞。可能的原因是连接体系有外源性核酸酶污染，使T-载体变为平端，连接后由于移码，而生成白斑。而2、3号泳道目的基因已成功转入感受态细胞中，所得片段大小符合目的片段。1234