外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

18实验八、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达一、实验目的1、了解原核表达载体的构成及表达调控因素；2、掌握大肠杆菌T7表达系统的构成及特点；3、熟悉外源基因在大肠杆菌中诱导表达的一般操作方法。二、原理见：1、姜泊等编注《分子生物学常用实验方法》（人民军医出版社）第九章《克隆化基因的表达与蛋白产物的检测》。2、李育阳主编《基因表达技术》（科学出版社，2001）第一章《大肠杆菌表达系统》。三、实验材料实验七鉴定的阳性菌。四、实验仪器高压灭菌锅、水浴锅、超净工作台、冰箱、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、超声破碎仪五、实验用具微量取液器、吸管头、1.5ml离心管、培养皿、三角烧瓶、14毫升离心管六、试剂（1）LB培养基（2）无菌双蒸水（3）100mg/ml氨卞青霉素（4）1mmol/LIPTG溶液19（5）LA固体培养基（6）PBS缓冲液(10X)15.4gNa2HPO4.12H2O,2gKH2PO4,80gNaCl,2gKCl,溶解后定容至1000mL，调pH7.3,高压灭菌后常温保存。工作液pH7.2。（7）2XSDS凝胶上样缓冲液100mmol/LTris-HCl，pH6.8,20mmol/LDTT,4%SDS。七、实验步骤1、取基因工程菌1#和基因工程菌2#，分别在LA培养板上划线培养，37℃，过夜。2、挑取单个菌落，接种于3mlLA培养液中，37℃，200-250rpm振摇培养，过夜。3、将菌液置于0℃数小时。4、取菌液1ml接种于100ml（用250ml三角烧瓶）LA培养液中。一共做4个三角烧瓶，1、2号为基因工程菌1#，3、4号为基因工程菌2#。37℃，200-250rpm振摇培养2-2.5小时，菌液的OD值（600nm）达0.4-0.5。5、向培养物中加入IPTG，使1、3号的IPTG终浓度为1umol/L，2、4号的IPTG终浓度为2umol/L。6、分别于加入IPTG前、加入IPTG后1、2、3、4、5小时，每次分别取出10ml培养物和1ml培养物，分别置于14ml离心管和1.5ml离心管中，5000rpm离心15分钟，弃上清液。向1.5ml离心管中的菌体加入100ul上样缓冲液，置于-20C冰箱保存。7、用300ulPBS缓冲液重悬14ml离心管中的菌体，转移到1.5ml离心管中，用超声破碎仪处理样品，20kHz，处理3S，间歇5S，共10次。注意：超声破碎细胞时样品容易发热，须在冰浴上进行。8、15000rpm离心，15min。9、将上清液和沉淀分开，分别加入上样缓冲液，保存于-20C冰箱备用。