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第七章微生物遗传和变异通过本章的学习，要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。2、真菌基因重组的原理和方法。3、微生物诱变育种的原理和方法。4、基因工程的基本原理5、基因表达的调控重点：细菌的基因重组微生物是遗传学研究中的明星微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。物种和代谢类型多样对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。遗传性：生物的亲代传递给其子代一套遗传信息的特性；遗传型：生物体所携带的全部基因总称；表型：具有一定遗传型的个体，在特定的外界环境中，通过生长和发育所表现出来的种种形态和生理特征的总和；变异：指生物体在某种内因或外因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变；饰变：同种遗传型的生物，在不同的外界条件下，会呈现不同的表型。第一节生物遗传信息的载体①1928年，F.Griffith；1944年O.T.Avery肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）转化试验。②1952年，A.D.Hershy、M.Chase的噬菌体感染实验。③1956年，H.Fraenkel-Conrat的TMV拆开和重建实验。一、证明核酸是遗传物质的经典实验1、经典转化实验——1928年，F.Griffth肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）•①加S菌DNA•②加S菌DNA及DNA酶以外的酶•③加S菌的DNA和DNA酶•④加S菌的RNA•⑤加S菌的蛋白质•⑥加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年Avery、MacLeod和McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子DNA。2、噬菌体感染实验——1952年，A.D.Hershy、M.Chase3、植物TMV重组实验——证明RNA是TMV的遗传物质二、微生物基因组原核生物染色体真核生物染色体外遗传成分质粒细胞器转座因子插入序列（IS）转座子（Tn）某些病毒（Mu噬菌体）转座因子：细胞中能改变自身位置（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段DNA序列。也称跳跃基因或可移动基因。插入序列：能在染色体上和质粒的许多位点上插入并改换位点，也称跳跃基因。转座子：能插入染色体或质粒不同位点的一般DNA序列，具有转座功能，本身也可复制。转座后在原来位置仍保留1份拷贝。某些病毒：能自我复制，也可整合到染色体或质粒上，且可在微生物细胞之间进行转移而可看作为一类微生物染色体外的遗传物质。转座子染色体基因组的编码功能分配与遗传图谱E.coligeneticmap一切具有自主复制能力的遗传功能单位都称为基因。它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的DNA片段。结构基因：是为细胞结构、组成(如细胞生化反应所需的酶)及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。调节基因：用于编码调节蛋白的基因。操纵基因：是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。重复基因：DNA片段重复跳跃基因：可在DNA上转移位置的基因（IS因子、Tn因子）信息大分子及遗传信息流乳糖操纵子调控模型第二节细菌的基因重组基因重组generecombination•两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新的基因型的过程。重组获得的后代具有新的基因组合，表现出不同于亲本的新性状。•原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过转化、接合、转导方式进行。一、转化转化：指外源DNA（人工合成的或者从供体细胞中提取的）不经任何媒介被直接吸收到受体细胞的过程。这些被转化的游离的DNA片段称为转化因子。转化后的受体菌，称为转化子。供体菌受体菌DNA片段转化需要的条件：1、感受态细胞：受体菌最容易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态2、外源游离DNA分子转化过程转化的特点：不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染(transfection)：转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。人工转化：在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，不是由细菌自身的基因所控制，是基因工程的奠基石和基础技术。用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。二、转导转导：是指通过噬菌体介导的DNA在不同细菌细胞间转移和基因重组的现象。细菌转导的类型：普遍转导局限转导完全转导流产转导低频转导高频转导转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体。获得了由噬菌体携带来的供体菌DNA片段的受体细胞称为转导子。在转导中被转移的染色体片段称为转导因子。普遍转导（generalizedtransduction）通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象。普遍性转导的三种后果：外源DNA被降解，转导失败。进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子流产转导完全转导转导DNA不能进行整合、重组和复制，也不迅速消失，而是表现稳定的转录、转译和性状表达。因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物。流产转导：局限转导（generalizedtransduction）指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特有基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。低频转导：指通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导，因其只能形成极少数的转导子而得名。高频转导：在局限转导中，若对双重溶源菌进行诱导，就会产生含50%左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物，用这种裂解物去转导受体菌，就可获得高达50%左右的转导子。低频转导裂解物正常噬菌体极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）转导颗粒双重溶源菌缺陷噬菌体和正常噬菌体同步复制高频转导裂解物部分缺陷噬菌（局限转导噬菌体）正常噬菌体等量转导颗粒局限转导子（大量）三、接合接合：是指通过两种细菌细胞的直接接触而将DNA从一种细菌转移到另一种细菌,并使后者获得新遗传性状的现象。1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.TatumE.colik12的多重营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。接合机制(大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。F因子特点：1）可经接合作用而获得；2）可通过一些理化因素的处理，而从细胞中消失；3）在大肠杆菌中，F因子的DNA含量约占总染色体含量的2%。F因子的四种细胞形式：a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。•F’菌株•当Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离其染色体组时，可形成游离的携带一小段染色体基因的F因子，特称F’因子。•携带有F’因子的菌株，其性状介于F+与Hfr之间，这就是初生F’菌株。初生F’菌株与F-菌株接合，可使后者转变成F’菌株，这就是次生F’菌株，它既获得了F因子，又获得了来自初生F’菌株的若干遗传性状。以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为F因子转导(F-duction)、性导(sexduction)。•在次生的F’群体中，大约有10%的F’因子重新整合到染色体组上，而恢复成Hfr菌。四、原生质体融合将遗传性状不同的两种菌的（包括种间、种内、及属间）原生质体融合成为一个新的重组子的技术。原生质体融合步骤：1、原生质体制备2、原生质体融合和再生3、融合子的选择第三节真核微生物的基因重组一、有性杂交二、准性杂交2、异核体形成1、菌丝联合3、核配4、体细胞交换和单倍体化有性杂交杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。粗糙脉孢菌的有性杂交第四节重组DNA技术基因工程：在基因水平上，改造遗传物质，即将分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。克隆载体（cloningvector）：负责将外源DNA片段运送到细胞中进行复制与扩增。限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）：是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类核酸内切酶。一、基因工程微生物在基因工程中的作用：1.微生物作为克隆载体:质粒、病毒、噬菌体2.微生物生产基因工程工具酶；1)、限制性核酸内切酶2)、DNA连接酶3.微生物作为克隆载体的宿主；1)、原核生物宿主：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌2)、真核生物宿主：酿酒酵母4.微生物作为基因产物的重要表达载体。5.理论基础（主要来自对微生物的研究）；6.微生物的多样性提供了丰富而独特的基因资源。获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定应用基因工程的基本操作结核分枝杆菌H37RV基因组pncAPCR扩增NdeI和XhoI双酶切T4DNA连接酶连接基因克隆：指利用DNA体外重组技术，将一个特定的基因或者DNA序列插入到一个载体DNA分子上，然后引入适当的寄主进行扩增。AmpAmppncAXhoINdeIOriOriMCS载体大肠杆菌感受态细胞AmpCaCl2或者甘油钙转化或者电转化转化子含氨苄青霉素的LB培养基克隆子二、基因突变基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何可遗传的改变。基因突变狭义：点突变（一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换）野生型（原始性状）基因突变突变型（新性状）广义：基因突变和染色体畸变（大片段染色体的缺失、重复、倒位）自发突变：在自然条件下发生的基因突变。诱发突变：利用物理化学因子处理微生物使其产生的突变。回复突变：突变菌株发生突变，回复到出发菌株的状态。基因突变分为基因突变的类型同义突变：碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的变化。错义突变：碱基序列的变化引起产物氨基酸的变化。无义突变：碱基的改变是密码子变为终止密码子。移码突变：碱基的缺失或插入使翻译的阅读框发生改变，从而使氨基酸序列完全变化。不同的碱基变化对遗传信息的改变不同：1）自发性2）不对应性3）稀有性基因突变的机制4）独立性5）可诱变性6）遗传性7）可逆性1、基因突变的特点：2、基因突变的机制：（1）碱基的置换（转换、颠换）碱基置换：碱基与碱基之间的交换导致突变的发生转换：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的碱基置换。颠换：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的碱基置换。腺嘌呤氨基式A－T配对腺嘌呤亚氨基式A－C配对结果：导致ATGC（转换）如果是ATCG（颠换）亚氨式氨式（2）移码突变frame-shiftmutant：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误（3）染色体畸变chromosomalaberration：缺失、重复、插入、易位、倒位1、碱基类似物-------5-溴尿嘧啶引起碱基的转换诱发突变指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。凡具有诱变效应的任何因素都称为诱变剂。酮式烯醇式2、与DNA碱基直接起化学反应的诱变剂亚硝酸引起DNA的碱基转换腺嘌呤次黄嘌呤3、插入染料D、辐射和热嘧啶嘧啶二聚体UV诱变育种：指利用各种诱变剂处理微生物细