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第四节核酸的凝胶电泳NucleicAcidGelElectrophoresisContentofTable前言一、琼脂糖凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、脉冲场凝胶电泳前言核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；优点：（1）便于分离;（2）便于检测;（3）便于回收：核酸凝胶电泳的基本原理1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移；2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。Home一、琼脂糖凝胶电泳Agarosegelelectrophoresis（一）凝胶的制备及电泳（二）DNA的迁移速率决定因素1DNA分子的大小双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；2琼脂糖浓度浓度越低，相同核酸分子迁移越快；3DNA的构象一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。4凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。5所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。6琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；不同类型琼脂糖的性质琼脂糖类型凝结温度/℃熔化温度/℃标准琼脂糖35~3890~95不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异40~4285~90高强度琼脂糖34~4385~95修饰的低熔点/凝点琼脂糖25~3563~653565超低熔点8~1540~45低黏性低熔点琼脂糖25~307038853075不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围浓度（%）标准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31~500.50.7~250.80.5~150.8~100.8~101.00.25~120.4~80.4~81.20.15~60.3~70.3~71.50.08~40.2~40.2~42.00.1~30.1~33.00.05~10.5~14.00.1~0.56.00.01~0.17电泳缓冲液常用的有TAE、TPE及TBETAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较都是常用电泳缓冲液。三者相比：1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。（二）凝胶载样缓冲液载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。6×凝胶载样缓冲液类型6×缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝室温0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚蓝4℃40%(m/V)蔗糖水溶液（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测通过染色,紫外灯下检测。主要有溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）染色法和SYBRGold染色法。1凝胶的EB染色使用EB染色注意事项（1）EB被认为是一种强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸（3）EB使用时的配制、贮存及使用EB常用水配制成10mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5μg/ml。（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。2凝胶SYBRGold的染色SYBRGold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。（四）凝胶中DNA的成像可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。（五）凝胶中DNA的回收现一般采用试剂盒回收：存在的主要问题：1不能有效的回收大片段DNA2不能有效回收少量DNAHome二、聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamidegelelectrophoresisPAGE在TEMED(四甲基乙二胺)催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。（一）聚丙烯酰胺凝胶的本质CH2=CH-C(O)-NH2(丙烯酰胺）CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2（N，N`-亚甲双丙烯酰胺）（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳种类1变性聚丙烯酰胺凝胶用于单链DNA片段的分离或纯化。变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。2非变性聚丙烯酰胺凝胶用于双链DNA片段的分离和纯化。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。用途：制备高纯度的DNA片段。（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围（bp）二甲苯氰FF溴酚蓝3.51000~20004601005.080~500260658.060~4001604512.040~200702015.025~150601520.06~1004512注:N,N`-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30;Home三、脉冲场凝胶电泳pulsed-fieldgelelectrophoresisPFGE为何选PFGE？超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但PEGE解决了这一问题。（一）PFGE工作的基本原理这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图（二）PEGE类型•垂直脉冲场电泳系统(verticalpulsedfield)•场翻转系统(fieldinversion)•旋转胶系统(rotatinggel)•箝位匀强电场系统(contour-clampedhomogeneouselectricfield)A-+AB-+B垂直交变电场系统场翻转系统箝位匀强电场系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+（三）影响分辨率的因素1脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。2电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。3电场夹角：电场方向的夹角常为1100-1200，研究证实900夹角也非常有效的。4温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4℃进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。Home