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实验电泳法——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离混合蛋白质【实验目的】1.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的基本原理。2.熟悉并掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法和常规操作。【实验原理】1.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N’,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂和引发剂作用下，聚合交联而成，具有网状结构的凝胶。以此为支持物，可以对蛋白质或核酸等大分子物质进行电泳分离。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质分子或其它生物大分子所带电荷的差异及分子大小的不同对不同组分进行分离。然而，有时两个分子量不同的蛋白质，由于分子大小的差异被电荷的差异所补偿，最终以相同的泳动速度向阳极移动，不能达到分离的目的。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)就是设法将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略而不计的程度。SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质的疏水相互作用，造成蛋白质三级结构的解体。由于SDS带有负电荷，使SDS-蛋白质复合物带有相同密度的负电荷，带电量远远超过了蛋白质分子本身的电荷，因而掩盖了不同蛋白质分子本身电荷的差别。【实验步骤】按下表配方制备凝胶：→将12％的分离胶（10毫升）加入玻璃板之间，缓慢加入蒸馏水密封，待胶凝固→倒掉上层水，加入5％浓缩胶（5毫升），插入样品梳，室温放置，待聚合反应完成→制备样本→小心取出样品梳，取预先制备好的样品10uL，缓慢加入点样孔中→按图所示安装电泳槽，加入适量电泳缓冲液：→恒压电泳约1小时，至指示剂到达胶板底部时停止电泳→卸开电泳槽，撬开玻璃板，小心取出凝胶，剥离分离胶→将凝胶放置在培养皿中，加入染色液浸没凝胶，脱色摇床摇晃30分钟后观察【实验结果】如图所示：┸【讨论与分析】Mark↓各种混合蛋白质╭────┸────╮1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理？答：①聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。②SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。③浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。2.凝胶配制时的注意事项答：①丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，故操作时应避免将溶液溅在手上。②过硫酸铵溶液以当天配制为佳。也可分装成小管，冻存于冰箱中备用。③聚合反应的速度与温度关系密切，应注意维持室温在20℃以上。