差示热量分析

微量热技术(Microcalorimetry)一、热分析技术及分类•热分析是在程序控制温度下，测量物质的物理性质随温度变化的一类技术。程序控制温度：指用固定的速率加热或冷却。物理性质：包括物质的质量、温度、热焓、尺寸、机械、升学、电学及磁学性质等。•热分析历史1780年英国的Higgins使用天平研究石灰粘结剂和生石灰受热重量变化。1915年日本的本多光太郎提出“热天平”概念。二战以后，热分析技术飞快发展。40年代末商业化电子管式差热分析仪问世。1964年提出“差示扫描量热”的概念。热分析已经形成一类拥有多种检测手段的仪器分析方法。热分析技术的分类:等热分析差热分析示差扫描量热分析热重分析逸出气体分析热膨胀仪热－力法热－光法电磁热分析放射热分析等热分析技术分类物理性质分析技术名称物理性质分析技术名称质量热重法尺寸热膨胀法等压质量变化测定力学特性热机械分析逸出气体分析动态热机械分析放射热分析声学特性热发声法热微粒分析热声学法温度加热曲线测定光学特性热光学法差热分析电学特性热电学法焓差示扫描量热法磁学特性热磁学法热分析四大支柱：等热分析、差热分析、差示扫描量热分析、热机械分析——用于研究物质的晶型转变、融化、升华、吸附等物理现象以及脱水、分解、氧化、还原等化学现象。——快速提供被研究物质的热稳定性、热分解产物、热变化过程的焓变、各种类型的相变点、玻璃化温度、软化点、比热、纯度、爆破温度和高聚物的表征及结构性能等。微量热法(包括等温滴定量热和差示扫描量热)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法.它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续和准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位(insitu)、在线(on-line)和无损伤地同时提供热力学和动力学信息微量热法具有以下特点：它不干扰蛋白质和核酸的生理功能，具有非特异性的独特优势，即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件。样品用量小,方法灵敏度高，测量时不需要制成透明清澈的溶液。量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。微量热法缺乏特异性。但由于蛋白质和核酸本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律。微量热法在生物大分子研究中的应用主有：酶促反应蛋白质去折叠/折叠抗原-抗体相互作用分子伴侣-底物相互作用药物-核酸相互作用物质的三个基本性质即能量、结构和动力学性质相互关联例.水分子中角H-O-H为105，因为这样分子能量最小；又如，多肽链在溶液中折叠成球蛋白，也是由于要使系统能量最小化。波谱学方法可以探测不同能级之间的跃迁，即研究样品分子在光的作用下能量状态的变化；而热分析的方法可以直接量测样品分子结构发生变化时能量的变化。原理热分析技术在升温或降温的过程中，物质的结构（如相态）和化学性质会发生变化，其质量、尺寸及声、光、电、磁、热、力等物理性质也会发生相应的变化热分析技术就是在温度程序控制的条件下测量物质的物理性质与温度关系的一类技术在程序控制温度下，测量物质质量的变化，产生了热重法、等压质量变化测定和逸出气检测等技术；测量样品几何尺寸的变化，则有了热膨胀法；测量样品的光学特性，有热光学法；测量样品的电学特性，有热电学法；测量样品的磁学特性，有热磁学法；测量样品的力学特性，有热机械分析和动态热机械法；测量样品的热力学性质，则有等温滴定量热、差热分析和差示扫描量热法(DSC)差热分析、等温滴定量热和差示扫描量热技术应用得最广泛。差热分析（DTA）是在程序控温下测量样品和参比物的温度差与温度的关系的技术。等温滴定量热（ITC）通过滴定反应热放出或吸收的热力学分析，提供结合反应相关的能量过程的定量特征。差示扫描量热（DSC）技术是在程序控温下测量输入到位置与参比物的功率差与温度的关系的技术。热分析所测定的热力学参数主要是热焓的变化（H）。由于在给定温度下每个体系总是趋向于达到自由能最小的状态，所以样品升温或降温的过程中，它可转变成具有不同自由能的另一种结构状态。分析伴随着结构变化所发生的热焓变化，就可以得到样品结构变化的某些信息。这就是用差示扫描量热法来分析生物大分子结构变化的基础。差示扫描量热法能精确、快速、方便地同时提供样品物理性质和能量性质相关信息，这是其它技术难以做到的。热分析既可以用于研究物理性质的变化，也可研究化学变化；不仅可测量热力学参数，也可提供一定的动力学信息。因此热分析在物质组分和结构研究及热力学和动力学研究上都是重要的分析手段。热分析所研究的物质可以是无机物（包括金属、矿物、陶瓷材料等），也可以是有机物；既可以是小分子物质，也可以研究生物大分子；因此，其研究的对象遍及物理、化学、生物、医药、食品、化工、材料、地矿、航天、环保、考古等多个领域。在生物学研究中，研究比较早的是生物膜、膜脂及模拟生物膜的模型膜；随着热分析仪器测量精度的提高，对生物大分子如蛋白质、核酸的研究也越来越普遍，越来越深入。热量的测量与量热仪热量是不能直接测量的，只能通过热效应间接测量。例如测量温差随时间的变化或温差随地点(位置)的变化，即T=T(t1)-T(t2)或T=T(x1)－T(x2)通过测量不同时间的温差间接测量热量的最古老的方法就是测量一定质量的水的温度变化:Q=CkTT=T(t1)－T(t2)是水温在t1到t2这段时间内的变化，Q是热量，Ck是热容（假定它在测量范围内是不变的）。通过测量不同地点的温差也可以测量热量:Q＝K(T)T(t)dt这里T表示温度，t表示时间，T是时间t时地点x1和x2的温差，T＝T(x1，t)－T(x2，t)，K是比例系数。不同的量热仪所依据的测量热量的原理千差万别，量热仪的分类也有各种方法。根据测量原理的不同，可以分为相变补偿型、热电效应补偿型、测量温差随时间变化型、测量温差随地点变化型等；根据运行模式不同，可分为等温静态运行、恒温环境静态运行、绝热静态运行、绝热动态扫描运行、恒温环境扫描动态运行等；根据构造原理分类：如双量热仪、单量热仪等。用人名命名，如Bunsen量热仪、Calvet量热仪等。无论采用哪一种分类方法，都可能会有某些量热仪难以明确归入某一类中去。例如，Calvet量热仪，可用电补偿热效应方式工作在恒温模式下，也可用恒温环境方式测量不同地点的温差。还有某些量热仪不在上述分类的范围以内。一、等温滴定量热法（IsothermalTitrationCalorimetry，ITC）等温滴定量热法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。等温滴定微量量热法（ITC）可以检测滴定反应过程中热量变化，用来表征生物分子间的相互作用，ITC迅速成为研究生物大分子结合反应的有力工具。通过滴定反应物到含有反应所必须的另一反应物的样品溶液中。每次滴定后，反应热放出或吸收，这些都可以被ITC所检测到。检测到的热效应的热力学分析提供了结合反应相关的能量过程的定量特征，可以直接测量与常温下发生的反应过程相关的能量学参数。ITC的用途：获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数KB、结合位点数（n）、摩尔结合焓变（ΔH）、摩尔结合熵变（ΔS）、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)等化学热力学参数描述一个结合反应ITC的应用范围：蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……ITC的特点ITC能测量到的热效应最低可达125nJ，最小可检测热功率2nW，生物样品最小用量0.4μg，灵敏度得到提高，响应时间（小于10s）ITC不需要固定或改变反应物，因为结合热的产生是自发的。获得物质相互作用完整的热力学数据包括结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat）ITC结构原理示意图ITC获取的结果示意图峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量以产生或吸收的总热量为纵坐标，以加入杯中的两反应物之摩尔比为坐标作图，可得整个反应过程的结合等温曲线ITC的应用1）蛋白质-小分子和酶-抑制物相互作用；2）蛋白质-糖类相互作用；3）蛋白质-蛋白质相互作用：如Jacobson等用ITC研究了人细胞RNA聚合酶Ⅱ转录因子TFIID的最大亚单位TAFII250的组蛋白乙酰基转移酶活性(Jacobsonetal.,2000)。日本Kanagawa科学技术研究所的Tahirov等利用ITC、CD和UV研究了AML1/Runx-1小结构域识别的DNA结构及CBFβ控制的构象调整，阐明了CBFβ与CBFα间的相互作用模式及前者调控后者结合到DNA上的机制(Tahirov,etal.,2001)。3）蛋白质-脂质相互作用；4）脂质间以及脂质-小分子相互作用；5）核酸-小分子相互作用；6）蛋白质-核酸相互作用；7）核酸-核酸相互作用；8）抗体研究：美国JohnsHopkins大学生物系的生物量热学中心是目前世界上从事生物量热学最活跃和处于领先水平的实验室，该中心的Freire小组(Murphyetal.,1993,1995)应用高灵敏度ITC分别研究了血管紧缩素与其单克隆抗体和酸诱导去折叠细胞色素c与其单克隆抗体的结合，发现上述结合过程均为焓和熵同时驱动的反应，实验结果表明，这些过程中溶剂释放所导致的熵增过量补偿了因结合而引起的构象熵的损失。9）受体相互作用；10）蛋白质折叠和稳定性：如美国的Wright小组应用ITC和核磁共振(NMR)等技术研究了核激素受体蛋白的一个结构域与甲状腺素及类纤维素A受体相互作用的热力学，发现虽然分开的结构域本身很凌乱，但是它们之间有高的亲和力而且是焓驱动的，并以一种独特的协同折叠的机制形成螺旋异二聚体。11）酶分析：应用等温滴定微量热法(ITC)结合高灵敏度差示扫描量热法(DSC)和分光光度法研究酵母细胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物—亚铁细胞色素c的热力学和动力学，并分析原盐效应对该酶活性的影响。应用等温微量热法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧阴离子等反应体系，获得了这些酶促反应的各种热力学和动力学信息,探讨了相关催化机理，同时用该法研究了博莱霉素催化切割DNA的反应，从热力学和动力学的角度严格地证明了博莱霉素在催化机制上类似于DNA切割酶，但其催化效率低于DNA切割酶，并用等温滴定微量热法研究了不同浓度盐酸胍存在时肌酸激酶催化ATP与肌酸间转磷酸化反应的热力学，从热力学的观点确定了该酶促反应为快速平衡的随机顺序反应，还建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力测定方法—微量热测活法。值得指出的是，ITC不仅被应用于研究蛋白质折叠/去折叠，而且被应用于核酸折叠，英国的Hammann等人利用ITC研究了镁离子诱导锤头状核酶折叠的热力学，发现镁离子与天然序列核酶的结合是一个强烈的放热反应，和镁离子与锤头状核酶不同序列变异体的结合有很大的区别，这些工作对于核酸折叠的热力学研究是良好的开端。ITC应用示例•ITC法测量结合/解离常数:•ChristianHerrmann等运用ITC研究了Ras与效应物和Cdc42与效应物的相互作用。Ras是一种在信号转导过程中起重要作用的蛋白质。可以向其下游的许多信号转导途径输送细胞内调控信号。Ras在非激活态，与GDP结合，当GDP被GTP取代时被激活，与其效应物（Raf，RalGDS，3-磷脂酰肌醇激酶）呈现更紧密的结合。Cdc42是一种GTPase，也是信号转导相关的蛋白。它参与细胞增殖调控和肌动蛋白细胞骨架的调控。C