冰冻切片免疫荧光取材

2.1.5免疫荧光技术检测PTEN蛋白表达。2.1.5.1标本制备1)取材：对照组和模型组分别随机选取15只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3只，麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100克，腹腔注射)，先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml以上），将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol磷酸缓冲液配制的4C4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳；2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水；脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋；4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用；5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。2.1.5.2免疫荧光染色步骤1)取出冰冻切片，室温放置30min，PBS洗10min×3次；2)0.4%Triton-100浸泡10min（1000mlPBS+4mlTriton-100）；3)PBS洗10min×3次；4)抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）；5)PBS洗10min×3次；用组化笔在距离组织2mm处划圈；6)5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h；7)一抗：甩去多余血清，不洗。滴加PBS配置的一抗，4℃过夜。阴性对照用PBS替代一抗；8)PBS洗10min×3次；9)二抗：滴加AlexaFluor488标记的驴抗羊荧光二抗（均为1：200配置），20~25℃室温避光孵育2h；10)PBS洗10min×3次；11)Hochest33342复染核10~20min；12)PBS洗10min×3次；13)抗荧光衰减封片剂封片，置于避光盒内；14)OlympusF1000激光共聚焦显微镜用488nm波长的激光器激发绿色，计算机进行数据采集和成像。