植入前胚胎染色体嵌合型的初步分析(一)

植入前胚胎染色体嵌合型的初步分析(一)【摘要】目的应用荧光原位杂交(FISH)技术对人类早期胚胎染色体的嵌合型进行初步分析，并探讨胚胎染色体嵌合型对常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功率以及植入前诊断的影响。方法对IVF-ET治疗周期中胚胎质量差、不适于胚胎移植和冷冻保存的正常受精胚胎以及在植入前胚胎性别诊断中诊断为男性胚胎、不能移植的38个胚胎进行FISH。结果38个胚胎共有293个核，杂交率为96.2%。其中正常胚胎12个，占31.6%，二倍体胚胎（正常胚胎+二倍体嵌合型胚胎）28个，占73.7%，嵌合型胚胎（二倍体嵌合型胚胎+异常嵌合型胚胎）19个，占50.0%。在≤4细胞期胚胎中，嵌合型胚胎占18.2%，但在5～8细胞期和≥9细胞期胚胎中，嵌合型胚胎的比例分别增至68.4%和50.0%。结论随着卵裂次数的增加，嵌合型胚胎所占的比例也增加，但嵌合型胚胎中嵌合细胞的比例却随之而降低。胚胎染色体的嵌合型可能是影响常规IVF-ET成功率的重要因素。应用FISH技术可准确地进行单细胞植入前性别诊断，但在进行植入前单基因诊断时，最好能同时活检2个细胞，以增加准确度。PreliminaryAnalysisofChromosomeMosaicisminPreimplantationEmbryos【Abstract】ObjectiveUsingfluorescenceinsituhybridizationtoanalyzechromosomemosaicisminhumanpreimplantationembryosandaccesstheinfluenceofmosaicismoninvitrofertilization-embryotransfer(IVF-ET)andpreimplantationgeneticdiagnosis.MethodsNormalfertilizedembryos,whichwerenotsuitableforembryotransferandcryopreservation,andmaleembryosinpreimplantationgenderdiagnosiswereanalyzedbyfluorescenceinsituhybridization.ResultsTwohundredandninetythreenucleuseswerefoundamong38embryos.Thehybridizationratewas96.2%.Twelveembryos(31.6%)werenormal.Twenty-eightembryos(73.7%)werediploidembryos,whichincludednormaldiploidembryosandembryoswithdiploidmoscaicism.Inaddition,19(50.0%)embryoswereconsideredtobechromosomalmosaicsduetodiploidmosaicismandabnormalmosaicsm.Thefrequencyofmosaicismincreasedfrom18.2%in≤4cell-stageembryosto68.4%and50.0%in5～8cell-stageand≥9cell-stageembryosrespectively.ConclusionThefrequencyofMosaicismincreaseswithsuccessivecleavagedivisions.MoscaicismmaybeoneoftheimportantfactorsaffectingthesuccessratesinIVF-ET.Identificationofsexbyanalysisofasinglecleavagecellisaccurate;however,itwouldbebettertobiopsy2cellstoreduceerrorsinpreimplantationgeneticdiagnosisofsinglegenediseases.【Keywords】Insituhybridization,fluorescence;Mosaicism;Preimplantationdiagnosis人类生育能力较大多数哺乳类动物低，35岁以下有生育能力的妇女每个排卵周期只有1/4的受孕可能〔1〕。而在常规试管婴儿体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET)中，每一胚胎移植周期的成功率也只有1/4左右〔1〕。单纯形态学参数只能粗略地估计胚胎的发育潜能，而80年代初，人们在研究胚胎的形态和着床的关系时发现，人类胚胎的染色体异常可能是影响胚胎着床的重要因素〔2〕。近年来，在应用荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）技术，分析植入前胚胎也证实，染色体嵌合型不论在形态正常与否的胚胎中均占有一定的比例〔3〕。我们从1998年11月开始，应用双色FISH分析胚胎的性染色体，1999年5月开始加用18号染色体探针进行三色荧光原位杂交技术，现将结果报道如下。资料与方法一、研究对象取1998年11月～1999年8月，本生殖医学研究中心IVF-ET治疗周期中胚胎质量差、不适于胚胎移植和冷冻保存的正常受精胚胎以及在植入前胚胎性别诊断中，诊断为男性胚胎、不能移植的胚胎共38个为研究对象，在受精后第2～4天进行固定。二、方法1.细胞固定：将胚胎置于酸性酞若液内，当透明带被消化后转移到N-2-羟乙基哌嗪-N＇-2-乙磺酸(hepes)缓冲液内，用细管吹打至细胞散开。取单个细胞放在已滴有1μlTween-20/盐酸(0.1%Tween-20,0.01mol/L盐酸)的玻片上，在解剖镜下观察直至细胞溶解。待玻片干燥后，在磷酸盐缓冲液内洗5min，然后依次用70%、85%和100%的乙醇脱水。玻片可在-20℃保存〔4,5〕。2.对照淋巴细胞的培养：用淋巴细胞行FISH杂交率的对照。将染色体正常的成年男性外周血0.6ml加入5ml淋巴细胞培养液RPMI1640中，摇匀后置于37℃培养箱中培养66h。在培养终止前加入秋水仙素（2μg/ml,0.5ml），然后用低渗液0.075mol氯化钾和固定液（甲醇∶冰醋酸为3∶1）处理。最后将细胞悬液滴在清洁的玻片上，镜下观察染色体的分散情况，玻片在-20℃保存。3.FISH:选用美国Vysis公司的染色体计数探针。其中X染色体探针用橙色标记，Y染色体探针用绿色标记，18号染色体探针用绿蓝色标记。变性时将玻片置于73℃70%的甲酰氨中5min，然后加入73℃已变性并混有杂交液的探针。盖上盖玻片后用橡皮水泥封口，37℃杂交炉内杂交2～4h。杂交完成后，将玻片置于73℃0.4×氯化钠/柠檬酸钠缓冲液/0.3%乙基苯基聚乙二醇（0.4×SSC/0.3%NonidetP-40）中2min和室温下2×SSC/0.1%NonidetP-40中1min洗脱非特异性杂交，最后加入10μl4＇，6-diamidino-2-plenylindole(DAPI)复染剂复染后在奥林巴斯BX60荧光显微镜下分别用罗丹明、异硫氰酸荧光素和Aqua滤片观察结果。4.结果评定:当细胞同时出现红绿信号各1个和两个绿蓝色信号时，诊断为男性胚胎（XY，1818）。仅当同时出现两个红色和两个绿蓝色信号时，才诊断为女性胚胎（XX，1818）。如果信号有分裂，但两个信号非常接近，互相有交叉或并排排列的两者之间距离小于信号大小的一半时判断为一个信号〔6,7〕。根据Delhanty等〔1〕的分类标准，将胚胎分成正常和异常两大类。正常胚胎即全部细胞核均为正常二倍体。异常胚胎再分为嵌合型、异常非嵌合型以及无规律分裂型3类。根据嵌合型胚胎中占主导的细胞为正常二倍体还是其他异常核型，将其再分为二倍体嵌合型和异常嵌合型。三、统计学方法采用χ2检验和相关分析。结果一、对照淋巴细胞检测结果在对照的507个男性淋巴细胞中，99.6%的淋巴细胞有杂交信号，94.9%显示正常男性核型XY，1818，异常核型包括3个XO，1818，5个YO，1818，5个XY，18，3个XYY，1818，1个XXY，1818。二、FISH结果38个胚胎共有293个核，282个核有杂交信号，杂交率为96.2%。11个核无杂交信号。正常胚胎12个，占31.6%，二倍体胚胎（正常胚胎+二倍体嵌合型胚胎）28个，占73.7%，嵌合型胚胎（二倍体嵌合型胚胎+异常嵌合型胚胎）19个，占50.0%。8个加用18号染色体探针的二倍体嵌合型胚胎中，单倍体/二倍体2个，三倍体/二倍体1个，四倍体/二倍体1个，非整倍体4个，其中单体性1个，染色体不分离3个。3个异常非嵌合型胚胎和4个无规律分裂型胚胎的碎片均≥25.0%。不同分裂期胚胎中，嵌合型胚胎所占比例不同。在≤4细胞期胚胎中，嵌合型胚胎占18.2%，但在5～8细胞期和≥9细胞期胚胎中，嵌合型胚胎的比例分别增至68.4%和50.0%，两者比较，差异有显著性(P＜0.05)。随着分裂次数的增加，二倍体嵌合型胚胎中，嵌合型细胞的比例随着胚胎细胞数目的增加而明显减少(r=0.74，P=0.001)。讨论一、嵌合型的发生率及其影响因素Munne等〔8〕在比较了4个中心的胚胎FISH结果后报道，胚胎染色体嵌合型的发生率波动在11%～52%。嵌合型及其他染色体异常发生率的波动受以下因素影响：(1)卵子培养和操作时温度的改变；(2)母亲年龄；(3)培养时氧浓度；(4)超排卵方案；(5)胚胎的形态及发育；(6)有无多核细胞；(7)检测染色体的数目和号数。其中，培养系统和超排卵方案影响最大。本研究中正常二倍体胚胎12个占31.6%，与Laverge等〔9〕的结果相近，嵌合型胚胎比例偏高，占50.0%，这可能与部分胚胎质量差、样本量少和培养系统不同等因素有关。二、嵌合型的发生机理一般认为，由于有丝分裂时发生错误染色体不分离或1～2个细胞极性改变可形成嵌合型胚胎。嵌合型发生的时间与卵裂有关。本研究中嵌合型胚胎所占的比例随着胚胎细胞数目的增多而明显增加，提示随着卵裂次数的增加，有丝分裂发生错误的风险也增加，所以嵌合型胚胎所占的比例也随之而增加。但嵌合型胚胎中嵌合型细胞的比例却随之而降低，如果嵌合型发生于第1次卵裂时，则所有细胞均不正常，嵌合型发生于第2、3次卵裂时，其不正常细胞分别为50.0%和25.0%〔6〕。本研究结果也支持这种观点。近年来，在进行卵子和胚胎极性的研究中，有学者提出嵌合型可能是胚胎发育过程中的正常现象。嵌合型细胞可能发育较慢或停滞，并有可能发展为滋养外胚层细胞，而不发展为内细胞团，所以不一定会影响胚胎的正常发育。因此，胎儿的染色体异常率远没有胚胎的异常率高〔10〕。三、胚胎嵌合型对IVF的影响在常规IVF中，胚胎的形态是最重要的评定胚胎质量的指标。但胚胎的形态学改变并不一定能真实地反映胚胎的发育潜能。虽然在形态正常的胚胎中嵌合型胚胎的比较低，但亦占有一定的比例。1995年Munne等〔3〕将胚胎分为发育停滞，发育缓慢和有碎片及正常形态3组进行X,Y,18,13/21号染色体的FISH，结果嵌合型胚胎分别为39.6%，25.2%和14.1%，3组之间差异有显著性。本研究中也可见无规律分裂的胚胎和异常非嵌合型胚胎的形态较差，胚胎碎片均≥25.0%。另外也有学者分析了其他染色体，如Delhanty等〔1〕报道，用X，Y和1号染色体探针三色FISH检测，有嵌合型的胚胎占30.0%。由于存在一定比例的染色体异常，因此在常规IVF中，每个胚胎移植周期的成功率一直在25%左右。从另一个角度来说，这可能也反映了人类对异常胚胎的自然选择和淘汰。四、染色体嵌合型对植入前诊断的影响尽管胚胎中有一定比例的嵌合型，但嵌合型不会对胚胎的性别诊断有影响〔11〕。本研究男性胚胎中无一例出现2个X信号和2个18号染色体信号。但据报