高效液相色谱法-(HPLC)

11高效液相色谱法(HPLC)HighPerformanceLiquidChromatographyHighPerssureLiquidChromatographyHighSpeedLiquidChromatography自学“薄层色谱法”讨论题1.荧光薄层板的组分是什么？它是否用于荧光化合物的检测？2.荧光薄层的展开动力？展开速度是否发生变化？3.推导容量因子与比移值的关系？4.什么是过压薄层色谱法？5.薄层色谱扫描仪的工作原理。。。。。。。。HPLC是在经典液体柱色谱的基础上,在色谱理论指引下，加以改进而发展起来的。特别是GC迅速成为一种仪器分析方法和社会需要分离分析难挥发复杂样品促进了HPLC的发展。近年来它以6-8%的增长率发展，目前年发表论文数已超过GC。2000年仪器销售全球第一。特性经典LCTLC/PCHPLCHPLC优势进样人工加样点样进样器准确溶液流动重力表面张力高压泵快速分离,重现性好检测和定量收集馏分检测显色连续检测高灵敏度,自动化实验结果棒式图斑点色谱图五高一广表11.1三种不同形式液相色谱的这样特征HPLC和经典LC比较HPLC和经典LC主要差别在于高效固定相、输液设备和连续检测。从速率理论得到塔板方程：uDkqkduDdkkuDduDdHsfMPMPMP22222)1()1(22涡流扩散、流型效应和停滞流动相慢传质均与dp有关，小的dp有利于提高柱效。高效固定相的重要特征是颗粒细小。固定相的慢传质与df有关，减少df有利于提高柱效。键合相色谱有效降低df，柱效进一步提高。※经典LC填料的缺陷填料通常是粒度大、范围宽、不规则,不易填充均匀,扩散和传质阻力大,谱带展宽加大。它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。※HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。达到传质阻力小,分离效率高。早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备，df大，这和GC一样，会大大降低色谱柱的柱效。现代HPLC填料多用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。(高效固定相带来什么新问题？)使用高效填料带来两个新问题：★柱流动阻力大大增大，需要采用高压泵输液★表面能很大，采用专业的装柱技术目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。※HPLC的特征采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器,从而实现了高效、高速和高灵敏度、定量准确,达到可与GC相媲美的分离分析性能。特别是结合计算机技术，HPLC已成为高度自动化和智能化的现代分析仪器。历史上出现不同的HPLC名称：★高压液相色谱(HighPressureLiquidChromatography)★高速液相色谱(HighSpeedLiquidChromatography)★高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography)总之，HPLC与经典LC相比,使用时更方便,对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具有较高的准确性和精密度。经典LC的特点：简便，填料一次使用。高效液相色谱仪基本装置流动相进样阀注入样品液色谱柱检测器色谱处理机高压泵流出液高效液相色谱仪方框图流动相→高压泵→进样器→色谱柱→检测器→积分仪◎流速控制◎阀进样◎温度效应旋转式六通阀a)取样位（load）b)进样位（injection）一般来说，色谱和电泳仪的仪器流程基本相同。从构成仪器的功能块可分为六大系统：流动相供给和输送系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录或数据处理系统和辅助控制系统。由于流动相的性质不同，流路系统的仪器结构有所不同。但记录和数据处理系统相同。◆色谱检测器◆色谱数据处理流动相供给和输送进样分离检测记录、数据处理色谱工作站（计算机）：控制显示温度控制收集◆流路系统（分析单元）：高、低压流路◆电路系统（控制单元）：信号传输与处理色谱检测器（对流出物进行连续检测）检测器实际上是一种换能装置,它将流动相中组分含量的变化,转变成可测量的电信号(通常是电压),然后输入记录器。从原理分析，任何一种分析鉴定方法都可能色谱检测器。理想的检测器应该是灵敏度高、线性范围大、对所有待测组分相同响应。一般检测器分为；●热学、光学、电学、电化学。。。检测器●总体性质检测器：热导、示差折射、电导溶质性质检测器：氢焰、紫外、荧光●通用检测器与选择型检测器●浓度型检测器和质量型检测器检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。◆检测器的线性范围大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性响应。实际上检测器的线性方程可表示为：y=ac,只有在三个数量级的浓度范围内满足0.981.02的线性响应的检测器才是线性的。◆灵敏度色谱分析中有三种不同的灵敏度表示法,检测器本身的灵敏度,整个色谱体系的浓度灵敏度和质量灵敏度。对于定量分析来说,重要的是色谱体系的灵敏度,因为它还包括柱子和仪器的其它部分的影响。检测器的灵敏度(CD),实际上指检测限,即通常指相当于两倍噪音信号的溶质浓度。而色谱体系的最小检测限应是柱外效应10%的最大进样体积所对应的二倍于噪音峰高所对应的样品浓度。而色谱分析最重要的是色谱体系的质量灵敏度,最小可测量：m=2CCD,C是柱内效应的标准偏差。或m=6.25e(1＋k),e是柱外效应的标准偏差。◆检测器的色区展宽对于毛细管气相色谱和高效液相色谱，检测器的色区展宽是柱外效应的一个主要来源。一般仪器厂商在设计时已把检测器的色区展宽减少到最低程度。色谱数据处理分离柱检测器记录仪积分仪色谱工作站色谱仪信号输出方框图色谱数据处理通过ADC转换器,把模拟信号转换成数字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。数据处理原理：◆峰的检测◆数据采集◆基线校正和重叠峰的分离自动处理人工修正●峰的检测峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个“阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采用下面两种方式判别峰讯号的变化：切线色谱峰的判断最小面积▲依照信号斜率的变化检测信号▲依照积分面积检测峰信号保留时间和峰面积的计算Aattntiiinrri1●基线校正和重叠峰的分离在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂移值参数来解决色谱仪自动定性和定量分析定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时,一般通过保留值来识别峰。但由于各种因素的影响,在重复多次分析中,保留值会有一定的变化,可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。◆“时间窗”法(TimeWindow)：tR±Δt对整个色谱图上各个峰的保留值都设定相同区间“时间窗”，规定图中各个峰保留时间的变化范围。该法设置简单，但用于识别保留时间相差很近的相邻峰不大方便。◆“时间带”法(TimeBand):tR(1±a%)对每个需识别的定量峰，都设定一个保留时间的相对变动范围。该设置较麻烦，但对不同峰可给出不同的变动范围，对识别相邻峰的分辨率较好，同时用于编组定量分析也很方便。色谱数据处理机和色谱工作站的差别色谱数据处理系统/机，积分仪功能：色谱数据处理ADC模数转换接口色谱工作站功能：色谱数据处理控制仪器参数ADC和DAC模数转换接口色谱智能化和专家系统简介色谱智能化是新一代色谱仪的发展方向,其特点是代替人的部分智能,选择分析方法和确定最佳色谱条件,并有条件地进行部分组分定性工作。这项工作不仅要求计算机技术,更重要的是,要加强色谱的基础理论研究,提高色谱操作技术,特别是制备出性能稳定的色谱柱,这样才能使操作规范化,以实现人工智能色谱。色谱专家系统是色谱智能化的一个重要组成部分,它从人工智能和数值计算方法出发开展研究,应包括以下几大部分：⑴分离模式和柱系统的选择；⑵预处理方法和检测器的选择；⑶分离条件最优化；⑷在线色谱峰的定性和定量；⑸色谱硬件的诊断。色谱柱（固定相、填料）色谱柱是色谱仪的心脏（起分离作用），其核心是优质固定相（填料）。进行色谱分离的首要工作是选择性能良好的色谱柱，即在确定的分离条件下分离效率高和分析时间短的色谱柱。色谱柱的选择应考虑：固定相类型的选择,主要取决于样品分离模式；柱填料的结构,主要指颗粒的形状大小、均匀性、比表面、平均孔径和孔容等；柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度色谱柱的牌号/厂商。色谱柱的结构色谱柱由柱管、填料、密封圈、过滤板、柱头等组成。应特别注意柱头规格及无死体积连接的特性。柱规格制备柱分析柱微径柱液相色谱(MicroboreHPLC)毛细管液相色谱(CapillaryHPLC)快速柱：高效短柱，如4.6×30mm,3mODS柱整体柱（Monolithiccolumn)整体柱(monolithiccolumn)是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相,具有制备简单、重现性好、多孔性优越、能实现快速、高效分离等优点。制备技术:硅胶整体柱，如Merck公司的ChromolithPerformanceRP-C18、SilicaROD和PrepROD；有机聚合物整体柱，如BIASeparations的CIM(ConvectiveInteractionMedai)等聚合物整体柱应用：高效液相色谱(HPLC)、毛细管电色谱(CEC)、微柱液相色谱(μ-HPLC)、固相萃取等系统上,成功地应用于生命科学、药物学、环境科学等领域的分离分析。何为无死体积柱头连接？无限直径效应（无限直径柱）？柱填料1．填料的特性1）基质材料①无机基体：硅胶、氧化铝、氧化锆和二氧化钛等②交联聚合物：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等③复合材料：无机基体复合一层聚合物2）形状：球形和不规则硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无机金属氧化物等。OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+HCl这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70℃以下，pH2～8范围内正常工作，应用广泛.硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相制备反应如下：（最常见类型！）3）粒度及分布范围4）孔径和耐压性一般硅胶的孔径在60-125A,但大孔硅胶的孔径为300-1000A。硅胶填料的产品差异主要取决于：①微粒基质的制备过程差异；②基质和键合物反应的差异；③柱装填技术专利的差异。一些键合键新技术：（1）RX技术(Txtechnology)“碱性脱活”（2）SB技术(StabilizedBonding)“高覆盖量”（3）封端技术(End-Capping)1）为什么要封端？2）聚合物柱的特点？封端常规聚合物固定相类型(Stationaryphase)1）按色谱保留原理把填料分为：吸附剂、离子交换剂、涂敷固定液、分级孔径或交联度填料等。2）按特性分类①硅胶：极性吸附剂②键合固定相（为什么要键合？）采用硅胶表面键合技术,对硅胶微粒表面进行修饰---硅烷化,使得硅胶表面带有不同的功能团,以适应不同的分离需要。目前在色谱填料中,键合相约占78%(其中C18占反相色谱的72%),硅胶约占10%)。A.基质：200-300m2/g的硅胶；聚合物,如聚苯乙烯和聚乙烯醇胶等。键合相类型烷基：C1、C2、C3、C4、C6、C8、C12、C16、C18、C22等反相柱；苯基：C6H5-,含有-相互作用；氰基：-(CH2)3-CN,带有给电子作用、羟基的氢键作用；正相、反相均可。氨基：-(CH2)3-NH2,弱阴离子型键合相,可用于糖分析。其它极性键合相还有：二醇基LichrosorbDIOL；硝基Nucleosil-NO2；二甲胺基Nucleosil-NMe2等。C.键合层（单层和聚合物）柱性能测试:应指定色谱条件和检测物质1．理论塔板高度2．峰不对称因子：应小于或等于1.23．相对保留值和分配比的重现性：精密度应优于5%和10%4．柱阻力因子：=0.1Pt0dp2÷(109L2)，多孔填料500-10005.折合