YYH-第五章-微生物的生长繁殖与生存因子

第五章微生物的生长繁殖和生存因子杨毅红冰岛间歇温泉硫细菌间歇温泉多发生于火山运动活跃的区域，水温可接近沸点。这种细菌竟能在对大多数生命来说极其恶劣的环境中生存下来。本章核心问题如何在实验室中培养微生物？微生物生长受那些物理因素的影响，它们如何影响微生物的生长？内容提要第一节微生物的生长繁殖第二节微生物的生存因子第三节其他不利环境因子对微生物的影响第四节微生物与微生物之间的关系第五节菌种的退化、复壮与保藏重点、难点重点：微生物的生长曲线、生长曲线在污水处理中的作用、微生物生长繁殖的生存因子和环境因子难点：生长曲线在污水处理中的应用第一节微生物的生长繁殖微生物的生长繁殖概念研究微生物生长的方法细菌生长曲线在污（废）水生物处理中的应用微生物生长量的测定方法一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。生长生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。繁殖群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程:群体生长=个体生长+个体繁殖一、微生物生长繁殖的概念细菌细胞分裂通常是：二等分分裂；酵母和少数细菌的细胞分裂通过出芽方式完成。世代时间简称代时（Ｇenerationtime,G）：就是一个世代所需的时间，因而也就是群体细胞数目扩大1倍所需的时间，有时也被称为倍增时间。单细胞微生物的世代时间：两次细胞分裂之间的时间。多细胞生物的世代时间：两次繁殖之间的时间。世代时间的大小反映了一种微生物繁殖速度的快慢。不同种的微生物，其生长繁殖速度不同。原核微生物的繁殖速度一般比真核微生物快。好氧微生物快于厌氧微生物。二、研究微生物生长的方法生长单个体微生物生长群体微生物生长分批培养连续培养（一）分批培养和生长曲线1.分批培养将少量单细胞微生物接种于一定量的液体培养基内，在适宜的条件下培养,并定时取样测定活微生物数目的变化。只有开始时的一次性投料和接种细菌（其余时间细菌根据环境变化自行生灭）（“坐吃山空型”）应用：生理特性研究、污水生物处理(SBR)等生长曲线的制作：接种适温培养定时取样测定生长量将少量细菌的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。生长曲线细菌纯培养生长曲线图生长速率静止期衰亡期细菌数目的对数值0时间t总菌数活菌数停滞期对数期0+_时期的划分：按照生长速率常数（growthraceconstant）不同为什么微生物数目用对数值作图？（1）停滞期特点：初期，适者生存，细菌总数下降；末期代谢活跃，个体体积、重量增高;停滞时期长短受多因素影响。细菌停数滞目期的对数值0时间t提问：为什么会出现停滞期呢？适应环境（合成相应的酶），营养储备（用于复制合成）？－“万事开头难”菌种：繁殖速度较快的菌种的停滞期一般较短；接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其停滞期较短，甚至检查不到停滞期；接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除停滞期；培养基成分：◇在营养成分丰富的天然培养基上生长的停滞期比在合成培养基上生长时短；◇接种后培养基成分有较大变化时，会使停滞期加长。影响停滞期长短的因素：根据上述原因选择接种何种状态的细菌停滞期会较长？对数期的细菌、静止期或衰亡期、受损细胞、富集培养基的细菌静止期细胞基本耗尽了各种辅酶或其他细胞成分受损细胞养伤修复富集培养基细菌需要合成“自力更生”酶。在实际工作中如接种菌种以启动新的水处理设施，投加新鲜污泥时，接种的细菌不习惯于新环境，会出现或长或短的停滞期…采用处于高效菌群对数期的菌种、增大接种量、尽量保持接种前后所处的培养介质和条件一致等方法来缩短或消除停滞期。提问：我们可以通过哪些手段缩短停滞期呢？（2）对数期/指数期细菌数目的对对数数期值0时间t如大肠杆菌在G20℃=2G35℃；伤寒杆菌在含0.125％的蛋白胨培养基中G=800min，而在1.0％时G=40min。特点：代谢最旺盛，代时最短，生长速率最快；群体中的细胞化学组分及形态、生理特性都比较一致。•提问：细菌的代时与哪些因素有关？种类遗传、个体健康情况(营养、环境条件)？G=(t2-t1)/n=(t2-t1)/3.322(lgX2-lgX1)R=1/G=3.322(lgX2-lgX1)/(t2-t1)X2=X1·2n两边取对数：lgX2=lgX1+nlg2（lg2=0.301）n=3.322(lgX2-lgX1)x2x1t1t2Lg细胞数/ml培养时间对数期三个重要参数（1）繁殖代数(n)（3）生长速率常数(R)（2）代时(G)注意细菌代时的测定必须以对数期的生长细胞作为对象。对数期的生长速率与时间的关系可能是线性函数，而不是指数函数。（溶解氧供应不足）（3）静止期细菌停数滞目期的对静止期对数衰亡期数期值0t时间产生原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，如碳氮比不合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;如果对数期的细胞分裂不受节制的连续进行，理论上一个代时为20min。重10-12g的细菌，经过48h的对数生长之后，其群体重量可达到地球重量的4000倍。特点：出生率＝死亡率;微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值;细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢.（4）衰亡期处于静止期的细菌继续培养，细胞的死亡率将逐渐增加，最终群体中活的细胞数目将以对数速率急剧下降细菌数缓目期的对对数衰亡期数期值0t时间产生原因：营养物耗尽；细菌进行内源呼吸，自身溶解；有毒代谢产物累积抑制繁殖。特点：生长速率负增长，群体中的活菌数目急剧下降，死亡率＞出生率；细胞形态多样，出现畸形，形成衰退型；蛋白水解酶活跃，出现菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势；芽孢细菌芽孢大量释放。衰亡期的长短与对数生长期一样在不同微生物中变化是很大的，主要与菌种的遗传特性有关。通过补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期的细胞死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。2.连续培养连续培养类型恒浊连续培养恒化连续培养•一方面连续进料，另一方面又连续出料。•原理：进料=补足营养(“污染物”)•出料=稀释菌浓度、毒物浓度（1）恒浊连续培养恒浊——培养基浊度恒定（实质是细菌数量恒定）新鲜培养基光电池光源流速控制阀出水发酵工业、细菌的生理生化研究反馈控制化——？新鲜培养基流速控制阀出水应用：污水生物处理（细菌生理特性研究、细菌的快速筛选等）。流速恒定进料营养物总量(2)恒化连续培养目前,污水连续生物处理法均类似于恒化连续培养；（流速不完全恒定）往往只处于生长曲线中的某一阶段……在连续培养中，微生物的生长规律与分批培养有何不同？不同的污水在生物处理过程中，其活性污泥中的微生物不仅种群不同，且生长状态也不同。可利用不同生长阶段的微生物处理不同有机物浓度的废水。三、细菌的生长曲线在废水微生物处理的应用大多数活性污泥处理系统的运行范围活细菌数目对数对数期稳定期适应期衰亡期活细菌重量mg/L活性污泥生长曲线①生长速率上升阶段提问：为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不断增大？A.营养物丰富，细菌增殖；B.细菌在细胞内以糖原、油滴等形式储存营养物，细菌个体重量增大生长率上升阶段mg/mL0时间t活细胞重量②生长速率下降阶段提问：为什么增长速率较前下降了？生长率下降阶段mg/mL0时间t活细胞重量营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降;代谢产物积累对细菌的某些酶产生抑制这些限制性因素还不是十分严重，细菌的代谢速度变慢，没有停止③内源呼吸及死亡阶段内源呼吸+毒物浓度更高（个体）瘦→死（群体）死亡率大于出生率从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降。提问：此时细菌的出生率是否为零呢？为什么？不是，利用死亡细菌的残体营养连续生物处理中的细菌状态表细菌的生长阶段应用举例特点停滞期无连续化稳定操作中无此阶段对数期高负荷活性污泥法(大部分区域)生长繁殖快，代谢活力强，能大量去除废水中有机物。缺点：粘液层和荚膜尚未形成，运动很活跃，不易自行凝聚成菌胶团，沉淀性能差，致使出水有机物浓度相对较高静止期生物膜法常规活性污泥法(大部分区域)仍有相当的代谢活力，细菌体内累积了大量贮存物，如异染粒聚β-羟基丁酸等，体表的粘液层和荚膜强化了细菌的生物吸附能力，自我絮凝、聚合能力强，在二沉池中泥水分离效果好，出水水质好。衰亡期低浓度污水延时曝气法污泥的厌氧消化废水有机营养物浓度过低，难以满足其他阶段细菌的生长需要进水对数期静止期衰亡期平推流式活性污泥法占优势1.适应期:a2.对数增长期:（a→b）活性污泥增长曲线的四个阶段3.减速增长期（b→c）4.内源呼吸期（c→d）四、微生物生长量的测定方法(一）测定微生物总数包括细胞数测定和细胞生物量的测定。其优点是测定过程快速，缺点是不能区分微生物的死活。电子计数器计数计数器直接计数染色涂片计数比例计数法比浊计数法1.电子计数器细胞悬液通过小孔导致电阻变化….较大的微生物可用原生动物、藻类和非丝状酵母菌2.计数器直接计数常用的微生物生长测定方法，用血球计数板在显微镜直接观察计数。细菌、酵母菌、藻类和原生动物等。计数器直接测定菌液滴染色（或不染色）面积1cm2血球计数板将菌液滴在血球计数板0.1ml的计数格中，固定染色后，在显微镜下选择数出若干个小格中的细菌数目，（一般数125个小格），根据比例关系折算出单位体积菌液中细菌的数量。计数格=4×4=16大格血球计数板1大格=5×5=25小格1小格=0.05mm×0.05mm=0.0025mm2总体积=16×0.1×25×0.0025=0.1mm3=0.1mL每小格深0.1mm盖玻片载玻片如125个小格中有90个细菌则(90÷125)÷0.0025=288个/ml菌液中细菌数目就为288个/ml。这种方法只能测定个体较大的细菌，细菌个体若太小，则由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。若适当稀释，效果较好。3.染色涂片计数将已知体积(0.01ml)的待测样品，均匀地涂布在载玻片的已知面积内(1cm2)，固定染色在显微镜下选择若干个视野计算细胞的数量计算涂片染色法0．01ml菌液均匀涂布，染色面积1cm2计数每个视野细菌的平均数量细菌数量=视野中的菌液体积=××个/mL目镜中的视野每个视野的面积由目测微尺的单元格量出，视野中菌液的体积按比例折算4．比例计数法将待测样品溶液与等体积的血液混合，然后涂片，在显微镜下测定细菌与红血球数的比例，因血液中的红血球数已知(男性400~500万个／ml，女性350~450万个／ml)，由此可以测得细菌数量。样品溶液与等体积的血液混合涂片细菌数量=（平均每个视野中细菌数量/红血球的数量）×400万个/ml如比例为5.5：1，则细菌数量=2.2×107个细菌/mL样品5．比浊计数法快速测定悬浮细胞其原理：细菌细胞不完全透光，光束通过悬浮液时会引起光的散射或吸收，降低透光度，透光度与溶液的混浊度即细胞浓度成正比。须将已知细胞浓度的样品按上述测定程序制成标准曲线，然后根据透光度或光密度值从标准曲线中直接查得细菌含量。分光光度法测浊度1234其他细菌计数法细菌数量10100100010000个/mL细菌数量制标准曲线菌液浊度（1）制标准曲线（2）测定菌液浊度，查表得出细菌数量50（二）测定活细菌数通过测定样品中活的细菌数量来间接地表示细菌的含量。