电压钳制和膜片钳制技术

第二节电压钳制技术Voltageclamptechnique利用微电极技术，虽然记录到细胞内的电变化过程，但不能阐明这种变化的原因。要阐明跨膜电变化机制，必须应用电压钳制技术。这一技术首先是由Cole及其同事设计，在经Hodgkin等人加以改进，用于神经电生理研究，弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。一、细胞膜的生物物理特性(Biophysicalpropertiesofcellmembrane)细胞膜上以脂质双分子层为支架，镶嵌着不同特性的蛋白质。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的极化状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质(cableproperties)的反映。(轴浆电阻与膜电阻、膜电容的组合，使电流对膜电位的影响起着依距离而衰减以及在时间上的延缓作用――神经的“电缆”性质)。细胞膜的电缆特性从它的等效电路及其时间常数和空间常数得到证实。(一)细胞膜的等效电路从电学特点上分析，细胞膜可等效地模拟为电阻－电容器。它具备细胞浆电阻（纵向电阻，Ro），膜电阻（横向电阻，Rm），膜电容（Cm）和膜电位（Em）四方面的电学特性，根据这四方面特性即可构成其等效电路（EquivalentCircuit）。outsideinside膜电位等效电路的简化图Cm膜电容Rm膜电阻Em离子平衡电位Ro细胞外液的纵向电阻（Ω/cm）Ri轴浆的纵向电阻（Ω/cm）RoCmRmEm+-离子通道等效电路细胞膜的等效电路是一个并联的阻容电路，膜活动时既有电压的改变，同时又有电流的改变。电位的改变可引起电容器的充、放电，也可用于电阻器上的电流流动。通过电容器的电流为Ic，通过电阻的电流为Ir。1纵向电阻（Ro、Ri）由胞浆的性质所决定，具有较高的电阻率，它与直径呈反比关系（直径大、电阻小，直径小，电阻大）。由于它的存在，使生物电的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行。它是单位长度的电阻，单位是Ω/cm，细胞外间质的容积很大，其单位长度电阻（Ro）较Ri小。2.横向电阻（redialresistance）即细胞膜本身具有的膜电阻。细胞膜由双层脂质构成，厚度很薄，但具有很高的电阻，即绝缘性。膜电阻表示离子通过膜的有限能力。膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电阻（Rm）的大小反映了膜结构电学方面的差异。2.横向电阻（redialresistance）膜电位、膜电流和膜电阻的关系遵循欧姆定律：Em=Im.RmI=V/R膜电阻越大，对电流的导通能力越小。膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电阻（Rm）的倒数膜电导（G，g）。I=gV（膜电位恒定的情况下，膜电导越大，膜电流也越大。不同的离子有不同的电导。电导的单位是Siemens(S).3.膜电容（capacity）表示膜的绝缘及储存电荷的性质。任何一种装置使两个导体中间插入一个绝缘体并安排在一起，称为电容器。细胞外液及细胞内液均为含电解质的溶液，可看作为两个导体；细胞膜是含脂质的膜，可视作为绝缘体。细胞外液-细胞膜-细胞内液三者组成了电容。3.膜电容（capacity）电容大小与细胞体积和细胞膜表面积有关。膜电容和膜面积呈正比，与膜的厚度呈反比。电容的单位是法拉第（F）。膜电容的测量可用于细胞膜表面积的测定，对推算某种离子通道在单位膜面积上的密度有一定帮助。4膜电位（membranepotential）当膜上离子通道开放而引起带电离子跨膜流动时，就相当于在电容器上充电或放电而产生电位差，即跨膜电位。膜电位的高低决定于跨膜电化学梯度；膜电位的高低与膜两侧的电荷成正比。在膜两側离子浓度不变的情况下，膜电位则取决于膜电导的改变（离子通透性的改变）。反过来，膜电导的大小又受到膜电位的控制（离子通透性的电压依赖性）。5膜电流（membranecurrent）任何电流都是电容电流（Ic）和电阻电流（Ir）两种形式通过细胞膜，前者导致膜电荷的改变，后者实际上是由离子携带流经细胞膜的。Im=Ic+Ir5膜电流（membranecurrent）电位的变化引起膜电容的充电或放电，而电流的变化则表现在膜电阻上的电流流动。Ic只在膜电位发生变化的一瞬间出现，若将膜电位固定在一定水平，记录到的仅为Ii（Ir），这是电压钳制技术的电学基础之一。(二)细胞膜的时间常数（timeconstant）时间常数是指膜电压随时间而改变的过程，用一常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随时间而改变的（缓慢）程度。也就是膜电位通过膜电阻和膜电容充电到63%或放电到37%所需的时间。τ=Rm×Cmτ=膜的时间常数(ms）;Rm=膜电阻（kΩ）Cm=膜电容（μF）Τ的大小与膜的电学性质有关，与膜的形状无关。(三)细胞膜的空间常数（spaceconstant）空间常数，是度量电压的空间衰减，即标志电压依距离而衰减的程度的一个常数。即:膜电位通过膜电阻和纵向电阻所组成的分流电路随距离的增大而按指数曲线规律衰减的速度.或表示膜电位按指数曲线规律衰减到37%所需要的距离。细胞直径越大，空间常数越大。(一)、定义利用负反馈原理将膜电位在空间和时间上固定于某一恒定的测定值，以研究动作电位产生过程中的离子通透性与膜电位之间的依从关系的技术。二、电压钳制技术的方法原理电压钳制术是利用负反馈电路，在一定时间内将跨膜电位（TransmembranePotential，Vm），保持在某个选定的电位水平，此电位称为保持电位（Holdingpotential，Vh），或者使保持电位突然变到某个特定的幅值的方波电位，称为钳制电位（Clampingpotential）或指令电位（Commandpotential，Vc）。(二)电压钳方法电容器电流Ic=d（CmV）/dt电阻器上电流IR流过膜的电流总量Idv/dt=0所有的电流将都是流过膜电阻的，这种电流将能反映离子的流动。电压钳技术的基本原理电压源（SG）使膜电位固定在特定的水平，并以放大器（AV）记录，该放大器与一个反馈放大器（AFB）连接，这一反馈电流通过膜，正好抵消因加电压而引起的离子电流，通过电流监视器测量电流。（三）电压钳技术的优缺点：很容易将膜电容电流与离子电流分开；可将膜电流分成不同的成分一INa、IK、Ica等（在灌流液中加入或去除某种离子）能精确反映由离子通道的开放和关闭，引起的膜电导的改变，能把离子通透性变化的时间关系加以描述。能分析离子通透性变化与膜电位的关系，在研究电压调节通道的行为方面有很大价值。1．优点必须在细胞内插入两个电极，对细胞损伤很大；对体积小的细胞，实验难以实现；对形态复杂的细胞，很维保持细胞膜各处电位一致；只研究一个细胞上众多通道的综合活动规律，无法反映单个通道活动的特点。2缺点:蛙坐骨神经元单个Ranvier结的电压钳记录（四）几种电压钳方法双微电极法单蔗糖间隙（SingeSucroseGap）法双蔗糖间隙（DoubleSucroseGap）法双微电极法单蔗糖间隙（SingeSucroseGap）法双蔗糖间隙（DoubleSucroseGap）法图1-2心肌双微电极电压钳法示意图Em：膜电位；Ec：控制电位；Vo：钳制电位；I：输出电流双微电极法单蔗糖间隙（SingeSucroseGap）法双蔗糖间隙（DoubleSucroseGap）法图1-3单蔗糖间隙法原理图图1-4双蔗糖间隙法原理图Em：膜电位；Ec：控制电位；Em：膜电位；Ec：控制电位；Vc：钳制电位；I：输出电流Vc：钳制电位；I：输出电流电极接触细胞负压吸引形成Ω形膜囊泡提起电极，囊泡与细胞脱离ABCD第三节膜片钳制技术膜片钳制技术（patchclamptechnique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12A)。一基本原理膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。膜片钳技术原理示意图Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。膜片钳与电压钳的区别膜电位钳制的方法不同；电位固定的细胞面积不同；研究的离子通道数目不同；(1)测量部分：(2)串联电阻补偿部分：(3)电容补偿部分：(4)指令信号控制部分：(5)电源部分：膜片钳放大器主要组成:电极电流监视器、灵敏度开关、滤波器开关、方式选择开关。用于校正全细胞记录时，由于电极和细胞内之间的通路电阻所造成的膜电位误差。用来补偿电压突然改变时引起的电容电流。将一定的电压加入到刺激信号中，形成一指令信号的保持电压。进行电压钳制时，它决定膜电位值，作电流钳制时，则决定电流值。提供放大器各部分的电源。贴附式全细胞记录模式负压吸内面向外式外面向外式拉细胞细胞细胞细胞拉并暴露于空气中四种经典记录模式(Cell-attachedorOncellmode)细胞贴附式膜片（cell-attachedpatch）优点：不破坏细胞的完整性，不需要胞内灌流，不影响细胞质且调制系统完整。可研究通过细胞对单通道的调制，也可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动。缺点：不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。于细胞牢固贴附于微管电极的尖由端而得名。它可用于记录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下研究通道的活动。贴附式记录（Cell-attachedrecording）细胞电极细胞膜胞外液胞内液内面向外式膜片(inside-outpatch)细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。特点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡形成。应用：可研究胞内信使物质cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等对受体型通道的调节，以及胞内激素对通道的调节。这种方式可使通道与细胞的调节机制脱耦联，使第二信使直接作用于膜内，引起通道开闭。内面向外记录（Inside-outrecording）电极脂质双分子层的内面面向浴液外面向外式膜片(outsideoutpatch)细胞贴附式膜片形成后，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，再将电极从细胞膜上拔起，但不暴露于空气中，被撕脱下来的膜便形成外面向外式膜片。优点：缺点：应用：可以任意改变胞外物质的浓度，有利于研究递质对膜离子通道外侧面的作用。实验中难以改变胞内成分，电极管必须充以低钙溶液以防小泡形成。可研究腺苷酸环化酶、蛋白激酶C等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等对受体型的离子通道研究。外面向外记录（Outside-outrecording）Patch-pipette脂质双分子层的外面面向浴液全细胞记录构型(wholecellrecording)记录的电流属于宏观电流（macroscopicalcurrent），是整个细胞离子通道活动形成的总和电流。若采用膜片钳放大器内的电流钳模式，还可以记录细胞的静息电位和动作电位。特点：①电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快，因而容易控制细胞内液的成分；②记录的是许多通道的综合电流，需改变内部介质以分离电流；③适合于对小细胞的电压钳位，对直径大于30μm的细胞很难实现钳制