酶促反应动力学实验报告

酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[S]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(Michaelis-Menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[S]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-Burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[S]的倒数作图，计算出其Km值。二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。实验步骤：实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响1.取试管9支，将0.01mol/L基质液稀释成下列不同浓度：2.另取9支试管编号，做酶促反应：3.混匀，37℃水浴保温5分钟左右。4.加入酶液后立即计时，各管混匀后在37℃准确保温15分钟。5.保温结束，立即加入0.5mol/LNaOH1.0ml以中止反应。各管分别加入0.3%4-氨基安替比林1.0ml及0.5％铁氰化钾2.0ml。试剂管号试剂管号6.充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510nm处比色。读取各管吸光度，做记录。(酶活性计算及Km值计算)实验计算：1.在37°C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。2.以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。Y=0.0581X+0.0242,Km=2.401实验二:抑制剂对酶促反映的影响1.取试管9支，将0.01mol/L基质液稀释成下列不同浓度：2.另取试管9支，做酶促反应：试剂管号试剂管号3.混匀，37℃水浴保温5分钟左右。4.加入酶液后立即计时，各管混匀后在37℃准确保温15分钟。5.保温结束，立即加入0.5mol/LNaOH1.0ml以中止反应。各管分别加入0.3%4-氨基安替比林1.0ml及0.5％铁氰化钾2.0ml。6.充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510nm处比色。读取各管吸光度，并计算各管酶活性。实验计算：以酶活性单位(v)的倒数1/v为纵坐标，以底物浓度[S]的倒数1/S为横坐标，在方格纸上描点，并连接各点，求该酶的Km值并与前面未加入抑制剂时测出的Km值作比较。Y=0.0832X+0.024,Km=3.47实验分析：通过绘图及分别计算无抑制剂与有抑制剂时酶的Km值，可发现，此抑制剂为竞争性抑制剂。通过绘图发现，其两条以1/v为纵坐标、1/S为横坐标的直线截距几乎相同，而加入抑制剂后，酶的Km值更大，此为竞争性抑制剂的特征：Vmax不变，Km变大。思考题一、除了双倒数作图外，你能举出其它能将酶动力学数据做出直线图的方法吗？1.海涅斯-沃尔弗作图法（Hanes-Wolffplot）双倒数方程式两边同时乘以[S]直线的斜率等于1/Vmax，横轴截距为-Km2.伊迪-霍夫斯蒂作图法（Eadie-Hofsteeplot）米氏方程式两边均除以[S]直线的斜率为-Km，直线的纵轴截距为Vmax二、为什么进行此种酶动力学测定时，所用各底物浓度不是按等差递增？在酶浓度和其他反应条件不变的情况下，反应速率V对底物浓度[S]作图呈矩形双曲线。当底物浓度较低时，反应速率与底物浓度成正比，反应为一级反应；随着底物浓度的增高，反应速率不再成正比例加速，反应为混合级反应；当底物浓度高达一定程度，酶被底物所饱和，反应速率不再增加，达最大速率，反应为零级反应。三、酶动力学实验中，哪些因素需严格控制？1.配制的各种试剂及反应液必须混匀。2.加酶液要准确快速，以保证各管酶促反应同时开始。3.加入酶液后要立即计时，计时要准确。4.0.3%4-氨基安替比林1.0ml及0.5％铁氰化钾2.0ml要依次加入，充分混匀，放置10分钟，放置时间不可过长。