食品生物技术导论-蛋白质工程与食品产业

广东药科大学食品科学学院《食品生物技术》课件E-mail:[e-mail]手机:[phone]郑传进第三章蛋白质工程与食品产业什么是蛋白质工程，蛋白质工程产生的动机是什么。蛋白质工程有哪些技术手段及其对蛋白质改造的基本原理蛋白质工程在食品工业中的作用。本章主题第一节、蛋白质工程概述催化功能：酶调节功能：激素结构功能：细胞骨架运输功能：血红蛋白免疫功能：免疫球蛋白运动功能：鞭毛、肌肉蛋白储藏功能：酪蛋白生物膜功能及神经传导等蛋白质的功能维持生命所必须的基本物质。用蛋白质诊断和治疗某些疾病。食品工业应用蛋白质制造各种产品。蛋白质重要性蛋白质分子量大，难于化学合成;蛋白质功能要在生理条件下才能发挥；蛋白质（酶）的专一性强。蛋白质应用受限的原因蛋白质工程蛋白质工程是指以蛋白质的结构及其功能关系为基础，通过基因修饰、蛋白质修饰等分子设计，对现存蛋白质加以改造，从而组建新型蛋白质，或全新设计新的蛋白质的现代生物技术。基因水平蛋白质水平化学改性物理改性蛋白质工程的技术手段酶法水解或聚合改性理性分子设计和定位突变融合蛋白技术体外定向进化全新蛋白设计改造现有蛋白初级改造：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入高级改造：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接从头设计合成新型蛋白质基因水平的蛋白质工程蛋白质的结构与功能关系第二节理性分子设计和定位突变技术中心法则蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA一、理性分子设计及其基本步聚理性分子设计在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建新的蛋白质分子。理性分子设计基本步聚(1)分离纯化目的蛋白，使之结晶,了解其空间结构的尽可能多的信息。(2)确定它的功能域。(3)分析结构和功能之间的相互关系，找出关键的结构和基团。(4)围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法（定位突变）去实施。(5)对经过改造的蛋白质进行功能性测定.定位突变定位突变是在已知蛋白质结构与功能的基础上，在已知DNA序列中取代、插入或删除选定的核苷酸，从而产生具有新性状的突变蛋白质分子的一种蛋白质工程技术。PCR介导的定位突变、寡核苷酸引物介导的定位突变、盒式突变二、定位突变（一）寡核苷酸引物介导的定位突变原理：用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。包括：Kunkel突变法、基于抗生素的“抗性恢复”突变法、基于去除特定限制酶切点的突变法，Kunkel突变法＋载体需改造的蛋白质基因纯化单链DNA合成三种含突变碱基的引物ssrrsr基于抗生素抗性“回复”的突变方法退火基于去除特定限制酶切位点的突变优点是保真度比重组PCR突变法高，缺点是操作环节复杂，周期长，克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制。寡核苷酸引物介导的定位突变优缺点（二）PCR介导的定位突变法原理：利用PCR将插入和缺失的突变碱基均设计在引物中，先用两对引物分别对核酸进行PCR扩增，通过重叠延伸产生带有部分重叠序列的两种PCR产物，这些产物经过混合、变性、复性和链延伸后，再用一对与两个待接片段外侧互补的引物进行第二次扩增，从而产生全长的异源杂合双链DNA。水溶性灰分测定方法TCGTAATGCGAAGCATTACGCTTCGTAATGCGAAGCATTACGCTAGCATGCAATGCGACGTAGCATGCAATGCGACGTAGCATGCAATGCGACGTTCGTACGTGCATACGCTAGCATGCAATGCGACGTAGCATGCATACGCTATGCGATCGTACGT插入TCGTATGATGCGAAGCATACTACGCTAGCATTGCGATCGTATGCGAAGCATACGCTTCGTATGCGAAGCATACGCTAGCATTGCGATCGTATGCGAAGCATACGCTTCGTATGCGAAGCATACGCTTCGTATGCGA缺失PCR介导的定位突变优缺点优点：操作简单，突变成功率100%；缺点：保真性偏低；后续工作复杂。（三）盒式突变盒式突变，又称片段取代法，利用目标基因序列中适当限制酶切位点，插入各种合适的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定DNA片段。包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。盒式取代诱变盒式突变优缺点优点：简单易行，突变效率高；可以一次改变多个位点或一个片段。缺点：合成DNA片段成本高，要求合适的限制内切酶位点。酶制剂的改造目标1.增强稳定性.2.提高酶活力.3.改变酶的选择性.三、定位突变技术在酶结构改造中的应用消除酶的被抑制特性枯草芽胞杆菌蛋白酶：碱性蛋白酶1985年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位突变技术，用19种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第222位残基上易氧化的Met，获得了一系列活性差异很大的突变酶。其中用Cys置换的突变型在1mol/L双氧水中可以保持一小时以上的酶活。T4溶菌酶及其突变体酶的特性引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性酶氨基酸及其位置半衰期/min野生型Asn14,Asn78,13AAsn14,Thr78,17BAsn14,Ile78,16CThr14,Ile78,25DAsp14,Asn78,11酿酒酵母磷酸丙糖异构酶及其突变酶在100℃下的稳定性转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性改变酶的最适pH值条件碱性条件下，80℃时使高果糖浆焦化产生有害物质，反应只能在60℃进行。反复调节pH过程产生的盐离子，去离子工序麻烦。淀粉糖化酶α-淀粉酶葡萄糖高果糖浆葡萄异构酶酸性条件碱性条件80℃稳定采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的区域置换为碱性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖异构酶的最适pH值变为酸性，即可在高温下进行反应。利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代时，突变体酶分解α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键的活性比例发生明显改变修饰酶的催化特异性利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程。理论来源第三节体外定向进化（非理性分子设计）一、蛋白质的体外定向进化蛋白质的体外定向进化蛋白质的体外定向进化又称为分子进化，就是在实验室条件下模拟自然进化机制，对编码蛋白质的基因进行诱变、重组，再通过高通量筛选方法选择出性能更加优良的蛋白质。不需要已知蛋白质的结构信息。随机突变+定向选择＝目标突变体细菌诱发突变的因素500C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！定向进化示意图随机突变+定向选择＝目标突变体蛋白质体外进化的过程1.通过随机突变或基因重组创造基因多样性，建立突变文库；2.突变体在适当生物体内表达；3.高通量筛选检出阳性结果，供进一步进化；4.此过程不断循环，直至获得预期性状的新型蛋白。定向进化与自然进化不同点1.进化动力不同2.进化方向不同3.进化速度不同定向进化定点突变的区别定向进化：突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以基因工程技术为基础的。定向进化突变体库产生方法重组：DNA改组、外显子改组、随机体外引发改组、合成改组突变：容错PCR、随机定位突变、交错延伸等方法DNA改组二、DNA改组将一群密切相关的DNA序列，在DNaseI作用下，随机酶切成许多片段，这些小片段之间有部分重叠碱基序列，可通过自身引导PCR重新组装成全长基因，从而建立分子多样性文库，对突变文库进行筛选，选择改良的突变体组成下一轮DNA改组模板，重复多次重排与筛选，直至获得性状较为满意的突变体。DNA重组装原理图1.DNaseI产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段容错PCR三、容错PCR容错PCR是指在利用Taq聚合酶进行目的基因的PCR扩增的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变的一种DNA体外进化技术。高通量筛选方法举例四、定向进化技术在酶制剂改造中的应用L－天冬氨酸酶(提高酶耐热性和酶活)。磷脂酶A1突变体（耐有机溶剂）乙内酰脲酶（D－型底物突变成L－型底物）。第四节融合蛋白技术融合蛋白技术概念一、融合蛋白技术的概念和用途有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因编码区首尾连接在一起，由同一调控序列控制所构成的基因表达产物，进而表达所需的蛋白。融合蛋白技术用途1.为解决在大肠杆菌等原核生物中表达出具有生物活性、折叠正确的组蛋白提供了可能。2.外源基因与宿主本身蛋白的部分序列构成融合基因以融合蛋白的形式表达时会减低宿主细胞对产物的降解。3.融合蛋白技术的出现为研究出更多更好的基因工程靶向药物提供了方便。PCR介导的蛋白质分子嵌合体形成二、融合蛋白技术的方法内含子介导的蛋白质分子嵌合体形成合成肽巯基化合物融合蛋白技术的应用三、融合蛋白技术的应用1.双功能酶2.靶向药物3.抗菌肽以往研究发现，在利用基因融合所构建的大的酶分子中，如果用以构成融合蛋白的各个酶分子的整个编码序列均保留于新的酶分子中，则融合蛋白一般均保留所构成的酶分子各自的酶活性。双功能酶并且发现在这些新构建的融合蛋白中，蛋白的正确折叠以及各个酶的活性部位均未受到影响，与单个酶相比，融合蛋白的酶的比活力为50%-100%，对于催化连续反应的两种或几种酶，利用基因融合的方法构成的融合蛋白可产生“邻近效应”（proximityeffect）。研究发现，β-半乳糖苷酶-半乳糖脱氢酶融合蛋白在一定条件下，其偶联反应产生NADH的速度是同时加入这两种酶的反应速度的两倍以上。同时过渡态时间缩短近四倍。定向药物定向药物一般由两部分组成：一部分是药物；另一部分是可以与病灶特异性结合的配基。通过融合蛋白技术将这两部分融合在一起，即可构成一个具有独特构象与功能的蛋白质。特点：它可以特异性地与靶细胞或致病因子结合，并把药物引导至病灶处，从而大大提高药物的效力。可以选择性地杀伤相应的抗原相关细胞或受体相关细胞，对其他无关细胞影响较少或无影响。配基常是肿瘤特异性抗体、细胞因子或激素等导向物质，药物常是毒性分子（如动植物毒素、放疗、化疗药物或细菌毒素等）。抗菌肽肽类抗生素又名抗菌肽，机体天然产生的抗菌肽由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们关注。它广泛存在于动植物体内，是由生物体特定基因编码的一类阳离子小分子多肽，具有广谱抗菌活性，是机体天然免疫的重要组成部分。研究结果表明，抗菌肽可以在亚毒性浓度下抑制HIV-1的基因表达，减少HIV-1的增殖。而人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶的抗菌活性外，也具有抗病毒的特性，已有研究证实人源溶菌酶具有抗HIV-1的作用。目前已有人构建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表达载体。并成功表达出了具有抗菌和抗病毒双重活性的重组蛋白。第五节全新蛋白质的设计和构建全新蛋白质设计是根据所希望的得到的蛋白质结构及功能设计氨基酸序列．称反折叠研究。一、概念核心问题是要让设计的序列要形成一个稳定独特的三维结构。假如我们选定的设计目标是水溶性的球蛋白，基本结构图样是由几段螺旋区组成的螺旋束，那么首先就要提出一个草图，包括α螺旋的数量和长度，相邻的α螺旋相互平行或反平行排列？相邻α螺旋之间的堆积及界面情况如何？提出基本结构图样二、基本步聚为了落实每个残基位置上氨基酸，有优先残基的统计学数据可供参考。对已知结构进行调查和分析的统计学结果表明，有些氨基酸对二级结构片段中的特殊位置有优选性。确定氨基酸顺序在初步选定了氨基酸顺序之后，再用MonteCarlo法或分子动力学计算将它的三维模型优化，继之以能量极小计算，使构象的能量水平达到最低和稳定。结构优化血红素结合蛋白、氧化还原活性蛋白质、DNA结