尿液蛋白质葡萄糖与酮体检测

尿液蛋白质、葡萄糖与酮体检测长沙医学院临检教研室陈丽华目的要求掌握：尿蛋白、尿糖定性试验和尿酮体Rothera改良法。熟悉：尿蛋白形成机制与分类、尿蛋白测定的质量控制。了解：尿酮体的产生。重点：尿蛋白、尿糖定性试验和尿酮体Rothera改良法。难点：质量控制肾单位是肾的基本功能单位，由肾小体和肾小管组成。肾单位与集合管共同完成泌尿功能。肾单位示意图肾小球滤过膜有筛孔屏障和电荷屏障。葡萄糖可完全滤过，白蛋白难于滤过。肾小球滤过膜示意图影响肾小球滤过的因素：①肾小球毛细血管血压。②囊内压。③血浆胶体渗透压。④肾血流量。近球小管重吸收葡萄糖示意图重吸收葡萄糖的部位仅限于近球小管。近球小管重吸收葡萄糖有一定的限度。正常情况下葡萄糖被全部重吸收入血。NaG脂肪酸乙酰辅酶A乙酰乙酸丙酮β羟丁酸酮体在肝细胞中的生成β羟丁酸乙酰乙酸乙酰乙酰CoA丙酮自肺、肾排出乙酰CoA酮体的氧化示意图酮体肝内生成肝外利用一、概述1.历史：1673年，弗雷德里克.德克斯(FrederickDekkers)用加热醋酸酸化尿液方法测定尿液中的蛋白。1790年，弗兰西斯.贺母（FancisHome）用硝酸法检测水肿患者尿液中的蛋白。1827年，理查德.伯瑞特（RichardBright）用加热的方法检测肾病患者尿液中的蛋白2.正常尿蛋白的含量和组成：尿蛋白总量为30~130mg/24h，一次随机尿为0~80mg/L。蛋白定性试验：阴性。主要成分是相对分子质量小的蛋白如β2微球蛋白、α2微球蛋白、溶菌酶等。3.蛋白尿：尿蛋白总量超过150mg/24h或100mg/L，蛋白定性试验：阳性。二、病理性蛋白尿分类及原因1、肾小球性蛋白尿：最常见（1）选择性蛋白尿：当肾小球损伤较轻时,以4－9万的相对分子质量中等的清蛋白为主，可伴抗凝血酶、转铁蛋白、糖蛋白及少量小相对分子质量的β2－M、Fc片断等。Pro:+++-++++.Pro大于3.5g/24h.最典型的是肾病综合症。（2）非选择性蛋白尿反映肾小球毛细血管壁有严重破裂损伤。以分子量较大和中等的蛋白质同时存在为主，Pro：＋－＋＋＋＋。定量0.5~3g/L。多见于原发或继发肾小球疾病。2.肾小管性蛋白尿:感染、中毒引起。小分子蛋白质尿，Pro：＋－＋＋。定量1~2g/L。常见于肾小管疾病。3、混合性蛋白尿：肾小管和肾小球同时损伤，大中小Pro均增多。4、溢出性蛋白尿：指血液循环中，出现了以中、小相对分子质量为主的异常蛋白质，如：游离Hb、肌红蛋白、溶菌酶、本周蛋白等增多，经肾小球滤出，超过了肾小管的重吸收最大能力，而大量出现在尿中。Pro：＋—＋＋。常见于MM。5、组织性蛋白尿：肾组织代谢产生、组织破坏分解的、炎症或药物刺激泌尿系统分泌的蛋白质等。Pro：±－＋；多为T－H糖蛋白三、生理性蛋白尿1.功能性蛋白尿：剧烈运动、发热、寒冷刺激、精神紧张、交感神经兴奋等，多见与青少年。2.体位性蛋白尿：又称直立性蛋白尿，特点：卧位时尿蛋白阴性，起床活动或久立后，尿蛋白阳性，平卧后又阴性。多见于发育期少年。3.偶然性蛋白尿：又称假性蛋白尿，混入多量血液、脓液、粘液或生殖系统分泌物，如：白带、月经血、精液、前列腺液等。尿蛋白血浆蛋白组织蛋白肾小球性肾小管性混合性溢出性组织性泌尿系统、泌尿外系统肾病综合征、肾病性蛋白尿原发、继发肾小球疾病肾小管间质病变、中毒性肾病浆细胞病、血管内溶血、肌肉损伤肾脏疾病、炎症、中毒、泌尿道结石泌尿道、生殖道炎症、出血、排泌物污染四、蛋白质定性检测方法（一）加热乙酸法1.原理：①加热煮沸使蛋白变性、凝固，②然后加酸使尿液pH接近尿蛋白质等电点，在含有适量无机盐状况下，蛋白质更易于变性沉淀。③加酸还可溶解因加热析出的磷酸盐或碳酸盐结晶所致的混浊。2、材料：酒精灯、试管、试管夹、滴管3、试剂：５％醋酸（一）加热乙酸法4.操作：（1）取大试管1支，用试管夹夹住管底部，加尿液至试管2/3处。（2）斜持试管下端，在酒精灯上加热下1/3处，煮沸即止。（3）加5%乙酸2~3滴，再煮沸后立即观察结果。（4）结果判断如下：实验结果结果判断相当含量（g/L）清晰透明无-0改变黑色背景下，±0.1~0.15极轻度混浊明显白色雾状，+0.2~0.5但无颗粒明显混浊，++0.6~2.0出现颗粒大量絮状沉淀+++2.0~5.0但无凝块严重混浊，++++＞5.0有大凝块5.注意事项（1）操作程序要对：加热加酸再加热。（2）加入醋酸量要适当，pH9或pH3可以产生假阴性。（3）加热时使底部受热，上部好作对照。（4）加热时管口勿对别人。加尿液1ml判断结果（二）磺基水杨酸法1.原理：在酸性条件下，磺基水杨酸的阴离子和蛋白质氨基酸阳离子结合，形成不溶性蛋白盐沉淀。2.操作：加尿液1ml加磺硫酸2滴1分钟内判断结果同加热乙酸法3.注意事项①本试验方法灵敏度高，极微浑浊无意义。②判断结果需及时。③尿酸盐和尿酸过多，可出现假阳性。④尿内含碘造影剂、大剂量青霉素等可使反应呈假阳性。（三）试带法原理：pH指示剂的蛋白误差原理①试剂模块中含有酸碱指示剂溴酚蓝,pH阈值3.0(黄色）~4.6（蓝紫色）。②pH3.2时，溴酚蓝产生阴离子，与带阳离子的蛋白质（清蛋白）结合形成复合物，发生颜色变化。从淡黄色变成绿色甚至是蓝色。③根据颜色变化可目测也可用尿液分析仪判读结果。五、蛋白质定性检查参考值：阴性1、加热醋酸法：（1）特异性强，干扰因素少，能同时检出A、G，但敏感性较低，一般在0.15g/L左右；（2）为蛋白定性确证实验。六、蛋白质定性检查方法学评价（3）加热乙酸法干扰因素及控制：①尿液偏碱（pH9）或偏酸（pH3）时呈假阴性，故试验前应先将尿液pH值调至5~6.②尿液离子强度低（无盐或低盐饮食者）时，可呈假阴性。可在标本中滴加饱和NaCl溶液1~2滴后再进行试验。③尿中混有生殖系统分泌物时，可出现假阳性，故用中段尿或离心后取上清液检测。④加热加酸再加热后，立即判读结果。2、磺基水杨酸法（1）操作简单，反应灵敏、结果显示快，灵敏度可达0.05－0.1g/L。（2）A、G、T－H糖蛋白和本周氏蛋白均呈阳性发应；（3）适于蛋白尿筛选试验，为干化学法的参考方法。（4）本法阴性可靠，阳性需进一步鉴别。（5）磺基水杨酸法干扰因素及质量控制①尿液pH值9或pH3时呈假阴性，故试验前应先将尿液pH值调至5~6.②大剂量青霉素钾盐、庆大霉素、磺胺、含碘造影剂时可出现假阳性。③尿中混有生殖系统分泌物时，可出现假阳性，故用中段尿或离心后取上清液检测。④判断结果应于1分钟内。3.试带法（1）本法快速、简便、易于标准化，可肉眼观察结果，也可用于尿液自动分析。（2）对A敏感，对G不敏感，可漏检本周氏蛋白。（3）适于健康普查或临床筛检，不适用于肾病疗效观察及预后判断和泌尿系统其他疾病的筛选。（4）试带法干扰因素和质量控制①pH影响：pH9时，呈假阳性；pH3时，呈假阴性。故试验前应先将尿液pH值调至5~6.②食物因素：检验前一天宜均衡饮食。③药物因素：假阳性：奎宁、嘧啶或尿中含磷酸盐、季胺盐等。假阴性：青霉素、庆大霉素、磺胺、含碘造影剂。④操作：试带浸渍时间过长，假阳性；过短或太长以至模块中试剂消失，假阴性。小结：一些干扰因素的影响加热乙酸法磺基水杨酸法试带法pH9假阴性假阴性假阳性pH3假阴性假阴性假阴性青霉素假阳性假阴性七、临床意义1、生理性蛋白尿定性试验：不超过＋；定量试验：小于0。5g/L（1）功能性蛋白尿：（4）偶然性蛋白尿：（2）直立性蛋白尿：（5）老年性蛋白尿：（3）摄入性蛋白尿：（6）妊娠性蛋白尿：2.病理性蛋白尿（1）肾前性蛋白尿：浆细胞病；血管内溶血；大面积肌肉损伤；酶类增多等。（2）肾性蛋白尿：1）肾小球性蛋白尿：肾病综合症；原发性肾小球肾炎；继发性肾小球肾炎。2）肾小管性蛋白尿：肾小管间质病变；重金属中毒；药物中毒；器官移植等。（3）肾后性蛋白尿：泌尿、生殖系统炎症；泌尿系统结石、结核、肿瘤等；泌尿系统邻近器官疾病；其他病理性蛋白尿等。一、概述1.糖尿:尿糖定性试验呈阳性的尿液。主要指葡萄糖。2.是否出现糖尿取决于3个因素:动脉血液中葡萄糖浓度每分钟流经肾小球的血浆量近端肾小管上皮细胞重吸收葡萄糖的能力二、尿葡萄糖测定的方法（一）班氏法（Benedict法）1.原理含有醛基的葡萄糖具有还原性，在高热及碱性溶液中能将蓝色的硫酸铜还原为黄色的氢氧化亚铜及红色氧化亚铜，出现黄色至砖红色沉淀物。葡萄糖+硫酸铜氢氧化亚铜氧化亚铜2.试剂班氏定性试剂3.操作如下OH--CHO-黄色红棕色蓝色加班氏试剂1ml加热取尿液0.1ml加入上述试剂中再加热冷却判断结果4.尿糖定性结果判断:实验结果结果判断相当含量（g/L）仍呈蓝色-蓝绿色，无沉淀±＜0.1绿色，有少量+0.1~0.5绿黄色沉淀黄绿色，有较多++0.5~1.0沉淀土黄色，有大量+++1.0~2.0沉淀砖红色沉淀，上++++＞2.0清液无色5.注意事项（1）试剂：尿液的比例为10:1,改变比例将影响灵敏度和结果。（2）糖尿病患者应于空腹或餐后2小时留尿标本检验。（3）存在大量尿酸盐时，煮沸后可呈绿色但久置后不变黄而呈灰蓝色，因此必须冷后观察结果。5.注意事项（4）尿中非糖还原性物质过多，如链霉素、青霉素、水杨酸、水化氯醛、VitC、中药大黄、黄岑等可呈阳性反应。所以应停3天后留标本检测，如静注VitC5天内不宜做尿糖测定。（5）蛋白含量过高，可影响尿糖定性测定，应用加热乙酸法除去蛋白后再进行检验。6.方法学评价为非特异性试验，可测定尿中所有的还原性物质，因此，尿中其它糖如果糖、乳糖和戊糖和一些还原性药物如氯醛、氨基比林、阿斯匹林、VitC和青霉素等都可出现假阳性。已逐渐被葡萄糖氧化酶试带法取代。7.参考值：阴性（二）干化学试带法采用葡萄糖氧化酶法原理进行。1.原理：葡萄糖氧化酶试带法：葡萄糖+H2O+O2葡萄糖氧化酶葡萄糖酸+H2O2H2O2+色原剂过氧化物酶有色物质（常用的色源剂有邻联甲苯胺、碘化钾、氨基比林）2.方法学评价（1）特异性强，灵敏度高，方法简单快捷可用于目视比色和自动化分析（2）干扰因素：①假阳性：a.尿标本容器残留强氧化性物质如漂白粉等；b.尿比密过低；②假阴性：a.标本久置葡萄糖分解；b.尿酮体浓度过高。c.VitC、L-多巴、水杨酸、氟化钠。（三）薄层层析法1.原理：在层析法中有固定相和流动相，两相间可做相对流动。当样品中各种糖随流动相通过固定相时，即反复发生吸附、脱附、解析或其他亲和作用，由于各种糖在上述性能上的差异而产生移动速度的差异，而相互分离。2.方法学评价：可作为确证试验。是鉴定非葡萄糖的还原性糖的首选方法。操作繁杂、费时，成本高，多用于临床和基础研究。三、质量控制1.检测前：容器、标本、消除VitC干扰。2.检测中：做好室内质控，严格遵循标准化操作规程。3.检测后：报告审核，与临床联系。氧化酶试纸法阴性，班氏试剂（还原）实验法阳性试纸质量问题葡萄糖以外的其他还原糖尿液中含有较高浓度的还原性物质存在少量葡萄糖伴有高浓度的还原物质氧化酶试纸法阳性，还原实验法阴性尿液标本被过氧化物或者次氯酸盐污染四、尿糖测定结果分析：五、临床意义1.血糖增高性糖尿：①糖尿病性糖尿。②其他内分泌异常：如甲亢。③应激状态：脑血管意外、突然情绪紧张。④饮食因素：一次性摄食过多糖。2.血糖正常性糖尿：即肾性糖尿。见于慢性肾小球肾炎、肾病综合征、新生儿糖尿等及妊娠晚期。3.其他糖尿：乳糖、半乳糖、果糖、戊糖等。尿糖检查的临床意义糖尿非葡萄糖尿葡萄糖尿胰岛外性糖尿生理性糖尿摄食性糖尿妊娠性糖尿神经精神性糖尿病理性糖尿真性糖尿半乳糖尿果糖尿戊糖尿其他糖尿酮体：脂肪酸分解代谢的中间产物丙酮2%乙酰乙酸20%β-羟丁酸78%酮血症酮尿一、尿液酮体检测原理（一）亚硝基铁氰化钠法原理尿中丙酮和乙酰乙酸在碱