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白细胞介素-2的研究摘要：综述白细胞介素-2及其主要临床应用、检测方法和基因工程研究方法。白细胞介素-2是一种在机体的免疫调节中发挥着重要而复杂作用的细胞因子，既可促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制T细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于治疗肿瘤和感染性疾病及自身免疫性疾病。关键词：白细胞介素-2；生物活性；临床应用；检测方法引言1966年，一些科学工作者发现，淋巴细胞在体外被激活后能释放出许多具有生物学活性的成分，它的化学组成是非免疫球蛋白的糖蛋白分子。这些分子能抑制巨噬细胞的迁移、调节白细胞的生长和功能。1969年首先由Dumonde把这些淋巴细胞产生的活性成分称为“淋巴因子”(Lym-phokines)。除淋巴细胞外，巨噬细胞、成纤维细胞、角质细胞和各种转化细胞均可产生淋巴因子。1976年Morgan等首先报道，用丝裂原(植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)等)刺激的淋巴细胞条件培养液(PHA-LyCM)可刺激T淋巴细胞在体外培养中长期生长。据此，他们认为PHA-LyCM中存在一种能刺激T细胞生长的因子，并将其命名为“T细胞生长因子(TCGF)”。随着研究的深入，人们发现PHA-LyCM不仅能刺激T细胞生长，还有多种其它生物活性，并依据不同的生物活性予以命名。例如：胸腺细胞刺激因子及细胞分裂因子(TSF，TMF)，杀伤辅助因子(KHF)及协同刺激因子(Co-Stimulator)等，其实这些都是同一种淋巴因子所表现出的不同生物活性。为避免名称混乱，1979年召开的第二届国际淋巴因子研讨会决定将这种“淋巴因子”命名为白细胞介素-2，即IL-2。1983年日本学者克隆了IL-2的基因，并成功表达。1992年美国FDA首先批准rhIL-2应用于临床。自从IL-2发现以后，人工培养和繁殖淋巴细胞成为现实，为免疫学领域的研究奠定了很好的基础。1IL-2及其受体蛋白1.1IL-2蛋白的结构天然hIL-2在体内主要由活化的I型辅助淋巴细胞(THl细胞)分泌，为分子量约为15.5kDa的糖蛋白，pI在6.6~8.2。成熟的IL-2分子由153个氨基酸肽链N端剪掉20个氨基酸残基的信号肽后剩下的133个氨基酸残基组成，它与其它的细胞因子在序列上无同源性。翻译后加工的过程还包括第三位Thr位点的糖基化和二硫键的形成。蛋白链中有三个半胱氨酸残基(Cys)，位于第58、105和125位。58位和105位半胱氨酸残基结合形成二硫键，使肽链折叠，125位半胱氨酸残基游离。研究者发现将125位游离的半胱氨酸残基突变为丝氨酸或丙氨酸时，仍具有生物活性，且不会与第58位半胱氨酸残基形成错误二硫键，增加了IL-2的稳定性，同时也消除了由第125半胱氨酸残基造成的二聚体，但是这样新型IL-2容易产生抗体，这是一大不足之处[1]。IL-2肽链折叠后才呈现活性，直链是无活性的，正确的二硫键对于IL-2活性的保持是必需的，但糖基化却与活性无关[2]。IL-2的二级结构有4个α螺旋区和一对β反平行折叠，各螺旋相互折叠使IL形成球状蛋白分子。磁共振(NMR)确定IL-2的四个α螺旋，分别为A、1l-29．B、53-73，C、81-97，D、116-131[3]。对IL-2的α螺旋结构研究结果说明α螺旋的破坏对其生物活性必定有影响。另外，IL-2与其受体结合需要酸性基团(Asp)，而较长的疏水侧链基团则妨碍这种结合，使其活性降低，甚至完全丧失。在生物学活性上，IL-2的氨基端和羧基端对于其结构和活性都起到关键作用[4]1.2白细胞介素-2受体（IL-2R）结构IL-2通过与细胞膜上的IL-2受体(IL-2R)结合来发挥其生物活性。IL-2R受体是一个复合体，由α链(55kd)，β链(75kd)和γ链(64kd)组成，3条链都有相似长度的外部控制区和不同的血浆控制区。β链的内部控制区最大(286个氨基酸残基)，而α链的最小(13个氨基酸残基)。Α链不具备信号传递功能，β和γ都属于I型细胞因子受体超家族，它们同时负责信号传递功能。只有在3条链同时存在时，IL-2才能与IL-2R以高亲和力结合[Ka（解离系数）=10pmol/L]。只有β和γ链的表达而失去α链的细胞．能够进行信号转导，但只能以中度亲和力与IL-2结合(Ka（解离系数）=1nmol/L)。只表达α链的细胞以低亲和力与IL-2结合，且无法进行细胞的内信号转导。γ亚基不单独与IL-2结合。高亲和力IL-2R主要存在于活化的T，B淋巴细胞及NK细胞，在人类外周血中约108个；大约90％NK细胞(静止状态)表达低水平的CD56抗原及中等亲和力IL-2R，约l06个。静止状态的巨噬细胞亦表达中等亲和力IL-2R，低亲和力IL-2R仅表达在静止状态的T细胞。IL-2R有两种存在形式，一种是与细胞膜结合的IL-2R(mIL-2R)。另一种是IL-2R释放到血液及其他体液中成为可溶性形式(sIL-2R)。当IL-2Rα从细胞膜上经酶解脱落后进入血液，就形成了可溶性IL-2R(sIL-2R)，sIL-2R可与mIL-2R竞争结合IL-2，使得活化T细胞周围的IL-2减少，减弱机体的自分泌效应，抑制已活化的T细胞克隆性扩增，发挥类似“封闭因子”的作用。sIL-2R释放量与T细胞激活程度及膜受体表达率有关，因此，sIL-2R被称为是T细胞介导免疫反应的标志。IL-2R的表达受IL-5和IL-6的调节，还受IL-2R/P55诱导因子，IL-2R诱导因子和IL-2Rα链抑制活性的调节。IL-2受体不仅能与IL-2结合传递信号，还能与其他的细胞因子发生作用。IL-2Rα亚基只与IL-2产生特异性结合，β链是IL-15受体重要的成员，而γ链则是IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受体复合物的一员。所以，IL-15R中含有β和γ两个亚基，IL-15对靶细胞能产生高度相似的生物活性。2IL-2的生物学活性IL-2的生物学活性有一大特点：不同种属的IL-2的生物学活性呈现下行性，即沿种系谱向上有约束性，向下无约束性。如人和猿的IL-2几乎可以作用于所有哺乳动物的T细胞，但其它哺乳动物的IL一般很少可以作用于人。对IL-2的氨基酸序列分析表明这与其受体结合部位氨基酸序列较保守有关，以及与氨基酸排列顺序和形成的空间构型也有很大关系[5]。另外一个特点是，IL-2具有很强的种属特异性，鸡IL-2（ChIL-2）与哺乳动物IL-2的同源性仅为20~30％。IL-2生物学功能很广泛，能够对多种细胞类型如T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和少突神经胶质细胞等产生作用，其中最显著的作用是影响T淋巴细胞的生长[6]。2.1促进T细胞增殖IL-2最主要的功能是促进T细胞的增殖。T细胞在受到丝裂原或抗原刺激后，表面出现IL-2受体并与IL-2发生特异性结合，结合后启动IL-2受体阳性细胞大量繁殖。IL-2受体必须在抗原刺激后，才能在T细胞表面表达，未受刺激的T细胞表面是不存在IL-2受体的。IL-2可刺激T细胞表面胰岛素受体、MHCII类抗原的表达，并产生多种淋巴因子如IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-B及CSF等。在体外，T细胞的增殖同样需要IL-2的促进作用。2.2诱导细胞毒性T淋巴细胞产生和增殖IL-2是抗原激活的细胞毒性T细胞前提细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞的主要因子。在IL-2存在条件下，细胞毒性T淋巴细胞繁殖明显增强，特异性地识别肿瘤相应抗原，特异性地杀伤肿瘤细胞，是肿瘤侵润淋巴细胞的主要细胞群。2.3对自然杀伤细胞(NK)的作用NK细胞是一种极为主要的杀伤细胞，具有很强的清除肿瘤细胞和被感染细胞的功能。NK细胞的活化、分化和增殖都离不开IL-2。IL-2不仅能促进NK细胞的增殖，还能促使NK细胞产生TNFα，IFNγ和GM-CSF等多种细胞因子，IL-2与IL-12协同作用增加NK细胞的杀伤能力。所以IL-2在NK细胞发挥免疫调节、抗肿瘤等功能上具有重要作用。2.4增殖分化B细胞作用IL-2能促进B细胞分化增殖，启动免疫球蛋白J链的翻译合成，增强抗体的分泌。所以IL-2可以使B细胞分化成为能够产生免疫球蛋白的活化细胞。2.5IL-2与其他白细胞介素等协同作用IL-2在细胞因子作用网络中起核心调节作用，和IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、肿瘤坏死因子、集落刺激因子等有协同作用。由于IL-2可以使NK细胞增殖，则IFNγ也随之增加。而TGF-β对IL-2的促细胞增殖有拮抗作用。所以今后对IL-2与各种细胞因子的正负调节作用研究将对免疫学基本理论发展和肿瘤治疗学发展起着重要作用。研究人员将小鼠的IL-2和IL-2R基因敲除对IL-2在生物体内的活性进行研究。实验证明IL-2对维持生物体的免疫平衡至关重要。首先，IL-2促进几乎所有种类T细胞的增殖分化。其次，IL-2负责诱导活化后的T细胞的凋亡，因此在调节免疫反应中发挥着重要的作用，IL-2的缺失会导致严重的自身免疫反应。3IL-2的临床应用及应用前景IL-2分泌水平的高低与多种疾病有密切关系。多数报道认为，肿瘤患者的IL-2产量和对IL-2的反应性都有不同程度的降低，随着肿瘤的恶化，IL-2产量更低下。艾滋病病人的1L-2含量仅为正常人的1/3。艾滋病病人用IL-2治疗后，可恢复极度低下的NK细胞活性和细胞毒作用。IL-2在机体免疫调节网络中的核心作用，与其他细胞因子的协同和拮抗作用，共同完成机体免疫机能的平衡调节作用；IL-2能促进T细胞、B细胞的分化、成熟，维持T细胞活性；还能促进细胞毒性T淋巴细胞的活性，并能使其转化为肿瘤侵润性淋巴细胞；促进NK细胞的活性并诱导成为杀伤肿瘤的新型细胞-淋巴因子激活的杀伤细胞；促进抗体形成，促进干扰素、肿瘤坏死因子及淋巴毒素的产生和释放。免疫佐剂是一类能促进、延长或增强抗原免疫原性和免疫保护效果的物质。IL-2作为一种免疫增强剂，显示出极为广泛的应用前景。hIL-2是研究最多的细胞因子免疫佐剂之一，其在艾滋病的免疫治疗和乙型肝炎病毒作为免疫佐剂的应用上取得了良好的效果。IL-2蛋白和狂犬病灭活苗联合使用，可以明显提高疫苗的免疫效果(保护率至少提高25倍)。3.1抗肿瘤治疗临床上常将IL-2单独或与其他化疗药联用治疗晚期肾癌、恶性黑色素瘤及癌性胸、腹腔积液等。基础研究已经表明，IL-2主要是间接发挥抗肿瘤的作用，其抗肿瘤的机理在于刺激、活化其效应细胞从而达到肿瘤治疗的效果。在恶性肿瘤的发病机制中，非常关键的是机体免疫功能失调和免疫功能低下的问题。在抗肿瘤免疫效应中，细胞免疫比体液免疫发挥更为重要的作用。参与肿瘤免疫作用的效应细胞主要有T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞三大类。其中细胞毒性T细胞(CTL细胞)起主要作用，它可通过其抗原受体识别肿瘤细胞的特异性抗原，并在T细胞的辅助下活化、直接杀伤肿瘤细胞；它亦可分泌淋巴因子如INF-γ、淋巴毒素等间接杀伤肿瘤细胞。NK细胞为非特异性的抗肿瘤细胞，具有广谱抗肿瘤活性，它可藉其表面的肿瘤细胞受体与肿瘤细胞结合，释放溶细胞素致肿瘤细胞死亡。活化的单核一巨噬细胞可直接杀伤肿瘤细胞，亦可释放肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子、溶酶体酶、蛋白水解酶和活性氧发挥杀伤作用。由于免疫功能低下，NK、CTL、LAK等杀伤细胞活性太低，不能正常地清除肿瘤细胞。此时提供外源IL-2能增强CTL抗肿瘤应答反应，诱导PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)成为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。LAK细胞在试管内可溶解自体的新鲜肿瘤细胞以及培养的肿瘤细胞，包括对NK细胞有抵抗的肿瘤细胞[7]。rIL-2与LAK合用治疗癌症曾引起世界性的轰动，LAK/IL-2对肾细胞癌[8]、黑色素瘤、肠癌等有明显疗效，对肝癌、卵巢癌、膀胱癌等有不同程度的疗效。LAK细胞毒作用是无组织相容性抗原限制的。临床上应用IL-2治疗肿瘤始于1985年，至今已经有二十多年的历史了，但对其抗肿瘤的活性仍在不断深入的研究中。其中研究比较热门的是IL-2基因治疗药物。将携带IL-2基因的真核