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EMSA实验材料：EMSA探针生物素标记试剂盒（20；1358）；化学发光EMSA检测试剂盒（100；1399）；正电尼龙膜（20；458）；细胞核蛋白提取试剂盒（50；462）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（200；170）；压片暗盒（1个；138）；PMSF试剂（1g;118）实验方法：一、探针制备：1.准备工作：A.取出TdTBuffer(5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapurewater溶解，并置于冰浴上备用。B.取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。如果待标记的EMSA探针为双链，95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA探针转变为单链的探针，然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA探针浓度为0.5μM。2.DNA探针的标记:Ultrapurewater29ulTdTBuffer(5X)10ul待标记探针(1μM)5ulBiotin-11-dUTP(5μM)5ulTdT(10U/μl)1ul总体积50ulA.参考上表设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。B.用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37℃孵育30分钟。C.加入2.5μl探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。3.TdT的去除:A.探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。B.12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探针。4.探针的纯化(选做)：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：A.对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。B.-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。C.4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。D.4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。E.加入50μlTE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20℃保存。5.生物素标记探针标记效率的检测：A.取5μlBiotin-ControlOligo(0.4μM)，加入196μlTE，混匀，稀释成10nMBiotin-ControlOligo(作为标准品)。取出适量10nMBiotin-ControlOligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。B.取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27μlTE，混匀，稀释成10nM生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。C.参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。对于经过梯度稀释的标准品和待测样品，分别取2μl滴加到膜上。在膜上滴加标准品或待测样品时，请注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一个湿的圆形小斑点。说明：如果条件许可，可以使用专门用于点杂交或狭缝杂交的设备进行探针标记效率的检测，探针的用量参考下表，浓度可以再稀释50倍，而所用体积可以相应放大50倍至100μl。探针浓度10nM5nM2.5nM1nM0.5nM0.25nMBiotin-ControlOligo2ul2ul2ul2ul2ul2ul生物素标记的探针2ul2ul2ul2ul2ul2ul探针量20fmol10fmol5fmol2fmol1fmol0.5fmolD.滴加完所有的标准品和样品后，将膜室温晾干。E.用紫外交联仪(UV-lightcross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联30-45秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射1-5分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射1-10分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。F.随后可以立即采用各种生物素检测试剂盒，检测出样品的生物素标记效率；也可以室温存放数天直至进行后续检测。G.如果最后采用的是ECL类试剂或其它类似试剂进行检测，则可以对比样品和标准品的灰度，从而计算出探针的标记效率。例如2fmol量的待测样品探针的灰度和1fmol标准品的灰度相同，则说明探针的标记效率大致为50%，待测样品中总探针的浓度约为1μM，而实际被生物素标记的探针约为0.5μM。探针的标记效率也可以通过建立标准曲线进行比较精确的计算。用于后续检测时通常要求标记效率不低于30%。有文献报道标记效率和3’末端的碱基无关，但和整个待标记探针的序列有关。由于在TdT的催化下可以在待标记探针的3’端加上多个Biotin标记的dUTP，因此有时会出现标记效率大于100%的情况。6.生物素标记EMSAA.对于步骤3B标记好的单链DNA探针，把正义链和反义链等体积混合(不可根据标记效率调整摩尔比例)。对于最初使用变性的双链EMSA探针进行探针标记的情况，直接进入下一步.B.加入退火缓冲液(10X)，使退火缓冲液的最终浓度为1X，混匀。例如待退火探针的体积为100微升，则加入11微升退火缓冲液(10X)。C.如下设置PCR仪进行退火反应：步骤温度时间说明195℃2分钟让oligo充分变性2每8秒下降0.1℃，降至25℃(注1)约90分钟退火34℃长时间保持暂时存放注1：如果所用的PCR仪不具备下降0.1℃的功能，也可以设置为每90秒下降1℃。D.退火反应结束后，-20℃保存标记好的EMSA探针。此时的EMSA探针已经可以直接用于后续的EMSA检测，也可以对探针进行适当纯化后再进行EMSA检测。二、核蛋白提取1.准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。2.对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。3.对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。4.每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)5.最高速剧烈Vortex5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。)6.冰浴10-15分钟。7.加入细胞浆蛋白抽提试剂B10微升。最高速剧烈Vortex5秒，冰浴1分钟。8.最高速剧烈Vortex5秒，4ºC12,000-16,000g离心5分钟。9.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。)10.对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)11.最高速剧烈Vortex15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex15-30秒，共30分钟。12.4ºC12,000-16,000g离心10分钟。13.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70ºC冻存。14.对于新鲜组织：A.把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4ºC进行。B.匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。C.4ºC1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)D.对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14c中抽提得到的细胞浆蛋白合并。三、EMSA胶的配制A.准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置)，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。B.按照如下配方配制20ml4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。TBEbuffer(10X)1ul重蒸水16.2ul39:1acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)2ul80%甘油625ul10%过硫酸铵(ammoniumpersulfate)150ulTEMED10ulC.按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。四、EMSA结合反应：A.如下设置EMSA结合反应：阴性对照反应：Nuclease-FreeWater7ulEMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2ul细胞核蛋白或纯化的转录因子0ul标记好的探针1ul总体积10ul样品反应：Nuclease-FreeWater5ulEMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2ul细胞核蛋白或纯化的转录因子2ul标记好的探针1ul总体积10ul探针冷竞争反应：Nuclease-FreeWater4ulEMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2ul细胞核蛋白或纯化的转录因子2ul未标记好的探针1ul标记好的探针1ul总体积10ul突变探针的冷竞争反应：Nuclease-FreeWater4ulEMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2ul细胞核蛋白或纯化的转录因子2ul未标记的突变探针1ul标记好的探针1ul总体积10ulSuper-shift反应：Nuclease-FreeWater4ulEMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2ul细胞核蛋白或纯化的转录因子2ul目的蛋白特异抗体1ul标记好的探针1ul总体积10ulB.按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。C.加入1µlEMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察到蓝颜色即可。五、电泳A.用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液