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实验设计的原理与方法张贺鸣新乡医学院药学院药理学教研室2010.09“凡事预则立，不预则废”引言实验设计的目的1.有目的、有计划、有步骤地进行实验。2.最大限度地减少实验误差。3.节省时间、样本、经费开支，减少人力物力财力，获得较高的效率。一、实验设计的目的与任务实验设计的任务：合理安排三要素1.受试因素（处理因素、施加因素、干扰因素）①要抓住实验中的主要问题②要确定处理因素与非处理因素③处理因素必须指标化④多因素的交互作用2.受试对象病人、动物、组织、器官、细胞等。3.受试效应选择指标指标选择要注意：①指标的关联性②指标的客观性③指标的灵敏性④指标的精确性⑤指标的特异性二、实验设计原则对照原则随机原则重复原则1.对照原则（control）例：某医师为了研究某中药煎剂的利尿作用，随机抽取10名健康人进行研究，结果10名健康人服药2小时内较未服药前平均增加100ml/小时，因此认为该中药煎剂有利尿作用。你认为该结论正确吗？并说明理由；你认为应如何设计？意义：⑴鉴别处理因素与非处理因素的差异。⑵减少实验误差，避免产生错误的结论。要求：⑴均衡:即组间一致，除处理因素外，对照组具备与实验组对等的非处理因素。⑵同步：对照组与实验组在整个研究进程中，始终处于同一空间和时间。⑶专设：为相应的实验组专门设立对照。不得借用文献上记载或以往的结果或其他研究资料作为本研究的对照。对照的几种形式⑴空白对照⑵实验对照⑶安慰剂对照⑷标准对照⑸弱阳性对照⑹自身对照⑺相互对照阴性对照阳性对照⑴空白对照对照组不加任何处理因素的对照。⑵实验对照实验对照：指给对照组施加与实验组操作条件一致的干扰因素。凡是对实验结果有影响的操作、溶媒、试剂等都应该设立实验对照。常用的实验对照有：①假处理对照:给对照组施加与实验组条件一致的操作称为操作对照，假处理对照在于控制操作影响产生的误差。②药物溶媒对照:以性状相同的溶媒作对照可防止误将溶媒的作用当作药物的作用，得出假阳性结果。⑶安慰剂对照①安慰剂:是指外观等与受试药物相同且无药理活性的物质，在临床研究中用来替代受试药物。安慰剂应该在剂型、包装、颜色、大小、形状、气味等外观上完全与处理组受试药物一样，使病人不能分辨，否则导致安慰剂的失效和实验的失败。②安慰剂效应:安慰剂产生与药物相似的药理作用。包括产生主观感觉和客观指征的变化。③安慰剂对照的设立给对照组受试者使用无药理活性的安慰剂称安慰剂对照。原则是在不损害病人健康的前提下使用。危重、病情发展迅速的病人，不得使用安慰剂。安慰剂对照与双盲法同时实施效果更好。对受精神因素影响较大的慢性疾病，应尽量采用安慰剂对照；新药和老药新用治疗慢性病的临床试验最好设立安慰剂对照；轻度精神忧郁、癔病可以使用安慰剂作为心理治疗的一部分；诊断已确定不需要药物治疗的病人可作安慰剂对照。⑷标准对照标准对照又称有效对照，要注意选择疗效被公认或肯定的药物或疗法，而且与所试验的药物或疗法是属于同一类型的。不能用安慰剂对照时，可用标准对照。即用公认的标准疗法(或常规疗法)作对照。例如：试验人参皂甙的抗心肌缺血作用，可用已知的有效药物普萘洛尔或长效硝酸酯类作对照。⑸弱阳性对照即以药效较弱的老药作对照，则可以肯定新药的价值。⑹自身对照即在同一个体上观察给药前后比较，这样可以减小个体差异的影响。⑺相互对照：几种处理(或水平)互为对照。2.随机原则（Randomization）⑴概念：①随机抽样:总体中每个个体有相同的机会被抽到样本中来②随机分组:每个实验对象分配到不同处理组的机会相同。③随机实验顺序：每个实验对象接受处理先后的机会相同⑵目的：在于克服偏性，避免人为因素的主观影响和其他因素。⑶方法：抽签法(简单随机、半随机、单纯随机抽样)随机数目表法、随机排列表：分两组、分三组随机数目表法分两组随机方法分三组或三组以上的随机法动物号123456789101112131415随机数33357267477734554570818273890除3余数020112110120020分组ACABBCBBABCAACA随机数目表法初步结果A组：1、3、9、12、13、15（6)B组：4、5、7、8、10（5）C组：2、6、11、14（4）最后结果A组：1、3、9、13、15B组：4、5、7、8、10C组：2、6、11、14、123.重复原则（Replication）意义：①实验的样本量要足够大②经得起重复实验的考验。“一个不可重复的研究是没有科学性的”。设计样本数时要考虑的因素⑴处理的效果⑵实验误差：⑶资料性质：等级分组计数资料计量资料的样本量⑷显著性水平：样本量a0.01大于a0.05⑸抽样误差：⑹实验结果的可能性：样本量双向(存在A≤B和A≥B两种可能性)所需样本数多,单向结果(只存在A≥B或A≤B一种可能性)所需样本数少.⑺实验设计类型:样本数量完全随机设计随机区组设计配对设计拉丁方设计样本大小的估计⑴一般情况下预定样本的大小①动物实验：大动物（犬、猫）5-15只中等动物（兔、豚鼠）10-20只小动物（大鼠、小鼠）15-30②临床：难治愈的病，疗效显著时：5-10例，急性病死亡率高的：30-50例，一般慢病：200-300-500例⑵用计算法估计①了解基本数据②确定条件：确定P值；确定把握度；确定是单侧还是双侧⑶计算样本大小的公式与举例三、实验设计的三大要素⒈明确实验目的实验设计时，首先要明确实验的目的，要解决什么中心问题，做到有的放矢。如要研究一个药物是否具有降压作用，可以通过观察两组动物一组给药、一组不给药后血压的变化情况表现药物的作用，通过给药前、后血压的变化观察药物的作用效果。⒉确定实验方法和指标根据实验目的和实验条件确定实验方法和观察指标。例如，观察一个药物是否具有镇痛作用，观察方法很多，有化学刺激法、热刺激法、电刺激法、机械刺激法等。无论何种方法，都有一定的观察指标。设计一些好的观察指标是体现实验的先进性和创新性的重要环节。观察指标是反映实验对象在经过处理前后发生生理或病理变化的标志。它包括计数指标(定性指标)和计量指标(定量指标)，主观指标和客观指标等。⑴客观性：最好选用各种仪器检测的客观指标，如体温、心电图、血气分析、瘤重、体重、血红蛋白含量、溃疡面积的大小、平滑肌收缩的长度等。指标的选定须符合以下原则⑵特异性：指标能特异地反映观察现象的本质，不会与其他现象相混淆。如高血压中的血压(尤其是舒张压)可作为高血压病的特异指标；血气分析中的血氧分压和二氧化碳分压可作为呼吸衰竭的特异指标。⑶重现性：在相同条件下指标所测的结果可以重现。重现性高的指标一般意味着偏性小，误差小，能较真实地反映情况。⑷灵敏性：是由实验方法和仪器的灵敏度共同决定的。⒊选取实验样本医学实验对象包括人和动物。为了避免实验给人带来损害或痛苦，除了一些简单的观察，如血压、脉搏、呼吸、尿量的实验可以在人体进行以外，主要的实验对象应该是动物(包括正常动物、麻醉动物及病理模型，既有整体动物，也有离体器官、组织和细胞等)，选择合适的实验动物对实验的成功有重要的意义。实验样本选择的条件⑴要选择接近于人类而又经济的动物：灵长类动物最接近人，但价格昂贵。一般常选择的实验动物为家兔、大鼠、小鼠、青蛙（蟾蜍）。⑵动物年龄、体重、性别最好一致。⑶根据实验目的、方法和指标而定：如小白鼠是实验室常用动物，适用于药物初筛，半数致死量(LD50)测定。由于其繁殖能力强、妊娠期短，也常用于避孕药的筛选；家兔体温恒定，适于解热药、热原试验。四、学生自行设计实验neostigmine,pilocarpine,acetylcholine的鉴别实验药品：0.01%新斯的明溶液(A)；1%毛果芸香碱溶液(B)；0.1%乙酰胆碱溶液(C)1.三种药物的基本作用和生物学特性⑴新斯的明(neostigmine)：易逆性抗胆碱酯酶药，可抑制AChE活性而发挥完全拟胆碱作用，即兴奋M、N胆碱受体，其对骨骼肌及胃肠道平滑肌作用较强，对腺体、眼、心血管及支气管平滑肌作用弱。因此，用药后有肌肉震颤，唾液腺、泪腺分泌增加，大小便失禁，中枢兴奋等症状。⑵毛果芸香碱(pilocarpine)：能直接作用于副交感神经(包括支配汗腺的交感神经)节后纤维支配的效应器官的M胆碱受体，尤其对眼和腺体作用较明显。因此，用药后有缩瞳，唾液腺、泪腺分泌增加，大小便失禁等症状。无肌肉震颤作用。⑶乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)：为胆碱能神经递质，其性质不稳定，极易被体内乙酰胆碱酯酶水解，且其作用广泛，选择性差，故无临床实用价值，可在研究中作为工具药实用。⒉鉴别实验方法⑴小鼠腹腔注射(ip)法：每组取3只小鼠，称重，标记。分别ip三种药物溶液0.1ml/10g体重，观察小鼠反应，初步判断ABC各为何药。【注】①新斯的明：小鼠肌肉震颤，唾液腺、泪腺分泌增加，大小便失禁，中枢兴奋，惊厥最后可能死亡；②毛果芸香碱溶液后，唾液腺、泪腺分泌增加，大小便失禁，无肌肉震颤作用；③乙酰胆碱溶液后，小鼠出现扭体反应，无其它反应(使用的为氯化乙酰胆碱，pH为3～5，酸性引起的疼痛扭体)。⑵家兔滴眼(缩瞳)实验法：每组取白色家兔2只，确定三只眼睛并分别测量瞳孔直径，分别将ABC三种药物溶液3滴滴入三只家兔眼内（方法：将下眼睑拉成杯状，滴入药液，提起眼睑与角膜接触并轻轻揉动1分钟），观察三只眼睛瞳孔直径有何变化，判断ABC可能各为何药。家兔除点眼外不得进行其它操作，尤其是耳缘静脉注射。【注】①新斯的明点眼，缩瞳作用不明显；②毛果芸香碱点眼，缩瞳作用明显；③乙酰胆碱点眼，缩瞳作用不明显。根据实验过程中出现的现象和实验结果，对设计的质量提出评论并提出需要注意的一些事项，对药物的作用给予进一步的讲解以加深对理论课内容的理解与掌握。五、实验总结