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Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。原理与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。WesternBlot试剂的准备1.30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。2.4×分离胶缓冲液（1mol/LTris-HclPH8.8）Tris18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH8.8，定容至100ml。3.4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris-HclPH6.8）Tris12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH6.8，定容至100ml。4.10%SDS：电泳级SDS10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH7.2，定容至100ml。5.5×电泳缓冲液（PH8.3）：Tris15.2g甘氨酸94gddH2O定容到1000mlSDS5g先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。6.10%过硫酸铵（AP）：0.1gAP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。7.2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液0.5mol/LTris-HCL(PH6.8)2ml10%SDS4mlβ-巯基乙醇1ml甘油2ml1%溴芬蓝1ml置4℃避光保存8.TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9.转膜缓冲液(TowbintransferBuffer)：即1×SDS-PAGE10.0.01mol/LPBS(PH7.4)：NaCl8.5g(12H2O)Na2HPO42.9011g(2H2O)NH2PO40.24g加ddH2O定容至1000ml11.封闭液:1×PBS中加入30ml5%（V/V）脱脂奶粉1.5g0.02%叠氮钠0.006g0.05%Tween-200.015g12.漂洗液（PBST）：含0.05%Tween-20的PBS溶液每1000mlPBS溶液中加0.5mlTween-2013.水饱和正丁醇：正丁醇50mlddH2O5ml加入瓶中震荡，使结合，存于室温。用时取上面一相加在凝胶上面。14.考马斯亮蓝染色法试剂：一般用G250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）染色液：90ml甲醇：水（1：1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g，用Whatman1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。（染色液多次回收利用）脱色液：90ml甲醇：水（1：1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液15.丽春红S染色色法试剂：2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液脱色液：TBS16.Aprotinin:为一58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装成小份，保存于-20度，每一小份用后应予废弃。17.PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液（1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20度。18.显色液：联苯胺显色液（DAB）DAB2ml10%H2O260μlPBS(0.1mol/LPH6.4)10ml19.三去污裂解缓冲液0.5mol/LTris-HCL(PH8.0)0.785g/100ml0.15mol/LNaCl0.8775g/100ml0.02%叠氮钠0.02g/100ml0.1%SDS0.1g/100ml100ug/ml苯甲基黄酰氟（PMSF）1ug/mlAprotinin1%NonidetP-40(NP-40)1.0g/100ml0.5%去氧胆酸钠0.5g/100ml凝胶的制备试剂总量20ml分离胶浓度（%）浓缩胶总量2.5ml810121530%丙烯酰胺4.0ml5.0ml6.0ml7.5ml0.4ml1.5mol/LTris-HclPH8.83.75ml3.75ml3.75ml3.75ml0.5mol/LTris-HclPH6.80.625ml10%SDS150μl150μl150μl150μl25μl10%AP150μl150μl150μl150μl8.3μlddH2O6.9ml5.9ml4.9ml3.4ml1.44mlTEMED8μl8μl8μl8μl2.5μl样品处理由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO40.1mM及NaF25mM）。注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。培养的细胞（定性）：1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。2.对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。3.100℃，1min。4.用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex2~3次。5.用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。6.待样品恢复到室温后上样。培养的细胞（定量）：1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。3.用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。4.12000g离心，4℃，2min。5.取少量上清进行定量。6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。组织：1.匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。2.12000g离心，4℃，2min。3.取少量上清进行定量。4.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。电泳1.上样前将胶板下的气泡赶走。2.所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loadingbuffer调整至与样品等体积。3.以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。4.在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。转膜1.电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。2.取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）3.转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。封闭及杂交封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200mlPBST或TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。1.封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。2.结合一抗：一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。3.洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。4.结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。5.洗涤：二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。发光鉴定Westernblot检测系统中常用交联酶两大家族就是辣根过氧化物酶HRP-ECL或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统-包括固定化抗原（WB）监测和核酸检测。但是做AP实验经常会遇到显色背景偏高的问题，所以就WB本身来说偏爱HRP的要比AP多。AP显色底物的生成物主要是蓝紫色，成像好，容易拍照。但是背景也偏高，整个显色过程更有技术性，有许多个人技巧在里面。如今由于HRP系统的化学发光系统已经不断改进，使得灵敏度不断提高，化学发光显色上与AP不相上下。就生色反应来说，AP显色得灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。1.HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。2.AP-NBT/BICP显色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。注：背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。增强敏感性若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：1.用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。2.将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。3.封闭40~60min。4.一抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。5.PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。6.二抗杂交，37℃1h。7.PB