大小鼠血清采集

-1-大小鼠血清采集一、仪器耗材（一）共用低温恒温离心机、-20℃冰箱、4℃冰箱、鼠笼、无害化冰箱、50ml离心管、500ml血清瓶、一次性橡胶手套、移液器（0.1~1ml、1~5ml）及配套吸头、废弃吸头存储盒、75%酒精。（二）小鼠1.5mlEP管、无盖离心管盒、弯头镊、眼科剪。（三）大鼠麻醉剂（3%戊巴比妥钠）、5ml无菌注射器、大鼠解剖台、手术剪、利器盒、止血钳、弯头镊、10ml无抗凝剂真空采血管（含一次性采血针）、止血纱布、电子天平（精度0.1~1g即可）。二、操作方法（一）小鼠血清的采集1、摘除眼球采血（1）使小鼠爬伸在笼盒上，左手拇、食指抓取小鼠双耳及颈后皮肤，小指固定尾部，用眼科剪减去小鼠待摘眼球脸部胡须；（2）中指将小鼠左侧前肢轻压在胸骨心脏部位，无名指按在腹部，捻动拇指，轻压取血侧眼部皮肤，使眼球充血突出；（3）用弯头镊夹取眼球；（4）根据需要捻动拇指与食指的方向，使血液从眼眶内以不同速度垂直流入1.5mlEP管中；（5）同时用左手中指轻按小鼠心脏部位，以加快心脏泵血速度；（6）当血液流尽时，用脱臼法处死小鼠。2、分离血清（1）将EP管中的血室温静置2小时；（2）再置于4℃冰箱内3~4小时或过夜；（3）待血液凝固血块收缩后，4℃3500rpm离心10分钟；-2-（4）使用移液器吸取上清液置于干净的50ml离心管中4℃冰箱暂存，待所有动物血清收集完成后，再次离心转移到500nl血清瓶中，保存于-20℃冰箱。3、注意事项（1）采血场所有充足的光线，室温夏季保持在25~28℃，冬季保持在15~20℃为宜；（2）防止血液浸入眼部周围毛发，否则会造成污染和溶血；（3）按压心脏时，用力一定要适度，若用力过度，一是会造成动物采血中途死亡，使采血不完全，二是有可能引起溶血现象发生，影响血清质量；（4）采血用的器材和试管必须保持清洁干燥；（5）采血时要防止小鼠挣扎，否则会损失比较多的血液；（6）若一边眼球摘除后眼部发生凝血，无法继续采血时，可将另一侧眼球摘除，用相同的方法继续采血；（7）血液凝固后不宜在4℃放置过久，否则会溶血；（8）移液器吸取上清液时注意不要将血凝块吸取出来。（二）大鼠血清的采集1、麻醉剂的配制3%戊巴比妥钠：称取3g戊巴比妥钠定容到100ml生理盐水中，混匀，5ml无菌注射器吸取备用。2、动物麻醉（1）将待麻醉的大鼠称重，并根据体重计算需要使用的麻醉剂数量，大鼠按0.1~0.2ml/100g体重注射3%戊巴比妥钠；（2）用一手抓住大鼠的尾根部提起置于较粗糙的台面或笼具盒上，一手抓住大鼠的尾巴向后拉，用另一手拇指、食指抓住头颈部皮肤，手掌握住大鼠上半身背部皮肤，即可将大鼠完全固定，进行下步操作；（3）手持已抽好戊巴比妥钠溶液的注射器，食指固定注射器前端。针头在鼠的下腹部腹白线稍右/左位置，从下腹部朝头方向平行地刺入皮下；（4）进针3~5mm后，再将针头与皮肤成45°角斜穿过腹肌，当感到有落空感时，停止进针，固定针头。回抽无回血、无肠液、尿液，便可缓缓推入药液；（5）将注射麻醉剂后的大鼠置于另外的笼盒中，3~5分钟后待大鼠不动弹处-3-于麻醉状态再进行下步操作。3、剖剪采血（1）将大鼠仰卧固定在解剖台上，背部可以放置一10ml废弃真空采血管以充分暴露腹主动脉；（2）75%酒精腹部消毒后，左手用止血钳夹住皮肤，右手用手术剪沿腹正中线“V”字型剪开腹腔，暴露脏器，止血钳钳住后将皮肤后翻以固定皮肤；（3）用止血纱布轻轻扒开腹腔内各脏器，用小镊子轻轻扒开血管周围脂肪（以清晰看清血管，不影响接下来进针时的视线为准）；（4）在脊柱前可见两条较大的血管，靠右边颜色稍白的1条就是腹主动脉；（5）用弯镊轻轻提起血管，右手持采血针，针尖斜面向下，入针角度约30°左右，在骨骼总动脉分支前方进针沿着腹主动脉向心端方向刺入，缓慢向前移动，深度5mm左右为宜，此时可见采血针头部管内有血液，如操作生疏针尖可插入深一些，防止刺破血管壁；（6）将10ml真空采血管向内有针头的套筒里缓慢地用力，使采血针刺入真空采血管中，血液便会自动流出；（7）当血液量达到所要求的刻度时就可以将采血管拔出，将采血针置于利器盒中。4、分离血清（1）将10ml采血管中的血室温静置2小时；（2）再置于4℃冰箱内3~4小时或过夜；（3）待血液凝固血块收缩后，4℃3500rpm离心10分钟；（4）使用移液器吸取上清液置于干净的50ml离心管中4℃冰箱暂存，待所有动物血清收集完成后，再次离心转移到500nl血清瓶中，保存于-20℃冰箱。5、注意事项（1）若注射麻醉剂后的大鼠超过10分钟未进入麻醉状态，则需再次麻醉；（2）扒开血管脂肪时注意轻盈，以免血管破裂出血；（3）为了便于观察采血量，可将鼠按逆时针方向转动90°（左手进针时顺时针转90°），取头部向左横仰卧位；（4）如采血管未装满还有血液未采集时完而采血管无负压时，可使用灭菌-4-注射器插入到套筒内，抽吸采血管内空气，使之形成负压；（5）采血场所有充足的光线，室温夏季保持在25~28℃，冬季保持在15~20℃为宜；（6）采血用的器材和试管必须保持清洁干燥；（6）采血过程中注意大鼠未完全麻醉产生挣扎，导致血液浪费和溶血；（8）血液凝固后不宜在4℃放置过久，否则会溶血；（9）移液器吸取上清液时注意不要将血凝块吸取出来。三、其他事项1、戊巴比妥钠严禁带出操作室，违者直接开除并自行承担一切法律责任；2、如需采集无菌血清，吸头还须高温高压灭菌，同时所有操作还应在超净工作台环境中进行。