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WesternBlotting常见问题及解决方法（参照Pierce公司讲座PPT）1.比较均一的高背景原因：解决办法抗体浓度太高优化/降低一抗和二抗浓度封闭液不适合比较尝试不同的封闭液封闭不完全封闭液的选择与优化增加封闭液中蛋白质浓度优化封闭时间和温度（RT至少1小时；4°过夜）封闭液中加入Tween-20；浓度0.05％抗体稀释液中加入Tween-20；浓度0.05％抗体与其它蛋白质交叉反应更换不同的封闭液；勿在Biotin/avidin体系中使用脱脂奶粉封闭降低二抗浓度检测二抗与膜的交叉反应性原因：解决办法漂洗不完全增加漂洗时间和缓冲液体积漂洗液中加入Tween-20；浓度0.05％曝光时间太长缩短曝光时间膜的问题使用干净镊子；戴手套操作换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润孵育时使用脱色摇床避免膜重叠，互相覆盖小心操作，勿毁损膜缓冲液污染使用新缓冲液过滤缓冲液2.斑点、发泡式或闪烁式的高背景原因：解决办法抗体浓度太高优化/降低一抗和二抗浓度二抗聚集0.2um过滤或更换新二抗封闭液不适合比较尝试不同的封闭液封闭不完全封闭液的选择与优化增加封闭液中蛋白质浓度优化封闭时间和温度（RT至少1小时；4°过夜）封闭液中加入Tween-20；浓度0.05％抗体稀释液中加入Tween-20；浓度0.05％抗体与其它蛋白质的交叉反应更换不同的封闭液；勿在Biotin/avidin体系中使用脱脂奶粉封闭减少二抗浓度检测二抗与膜的交叉反应性原因：解决办法膜没有正确湿润使用干净镊子；戴手套操作换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润孵育时使用脱色摇床避免膜重叠，互相覆盖小心操作，勿毁损膜缓冲液污染使用新缓冲液过滤缓冲液仪器污染保证所有仪器，用具干净确保膜上无残留胶3.信号弱或者无信号原因：解决办法转膜不完全1.转膜后，染胶以决定转膜效率2.使用Memcode染膜以决定转膜效率3.保证转膜时胶与膜充分结合4.滤纸－膜－胶，电极方向正确装配5.根据说明书，对膜进行处理如湿润6.电转时防止过热7.使用阳性对照或预染Marker8.优化转移时间和电流9.使用Pierce转膜缓冲液10.保证样品处理时，样品不被破坏（抗原决定簇）蛋白质与膜结合不充分加20％甲醇于转膜缓冲液；低分子蛋白质透过膜；使用小孔径膜抗体增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体丧失活性抗原不足增加上样量抗原被封闭液遮蔽试用不同的封闭液优化封闭液中蛋白质浓度缩短封闭时间缓冲液里有叠氮钠去掉叠氮钠曝光时间太短延长曝光时间底物孵育时间太短5分钟膜的选择错误Pico底物首先推荐使用NC，PVDF膜需要条件优化Duro/Femto底物，推荐使用NC；PVDF；尼龙或电荷修饰的尼龙膜底物丧失活性Pico/Duro底物室温稳定12个月Femto底物室温稳定至少6个月底物与二抗孵育发光检测保证两种底物成分没有交叉污染膜被剥离过剥离会导致抗原丢失或变性避免重复检测膜上蛋白质被消化（gelatin)封闭物质可能有蛋白质降解活性蛋白质在储存过程中降解重新制备样品4.非特异性条带原因：解决办法：底物太灵敏交叉反应抗原浓度太高抗体浓度太高降低抗体浓度SDS非特异性结合到胶上的蛋白质1.转膜后充分清洗2.不用SDS5.弥散型条带原因：解决办法：抗体浓度太高降低抗体浓度蛋白质上样量太多降低蛋白质上样量6.白色条带/黑点/信号下降太快原因：解决办法：抗体浓度太高1.降低抗体浓度，特别是二抗浓度7.部分区域发黑或有信号原因：解决办法：不完全转膜1.确保胶与膜之间无气泡2.湿润膜3.用干净的镊子或手套以避免污染4.换新的膜5.保证膜孵育时，膜没有互相覆盖