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1WesternBlot实验方法一蛋白提取1、切取组织，置于已经用记号笔标记好的EP管底，称重（mg）插入冰盒中，注意不同样品间所用剪刀、刀片、镊子等要擦拭干净。2、配置裂解液：980ulRiPA+10ul10%PMSF+10ul蛋白酶抑制剂混匀机混匀。3、每EP管中加裂解液(10ul/1mg)，超声（time--pulse--AMPL--start--O）5s停5s循环1min,振幅25%（AMPL参数）,再裂解30min。4、于40C冷冻离心机中预冷15min，1200r/min.将裂解后的组织液离心15min，取上清即为所提蛋白，至于一个试管内，用酶标仪测浓度，再高温变性，再上样，多余的试剂置-80℃保存。5、用玻璃小烧杯配制定量用的试剂：（2mlH2O+500ul考马斯亮蓝）+36ulH2O+4ul样品，另加一个标准品BSA(10ul/ml)对照组，一个空白对照组。6、(4倍)上样缓冲液稀释成（1倍），即:30ul上清液+10ul(4倍)上样缓冲液（红色的，购买的），震荡混合+离心，高温振荡机中变性，950C，5min，注意使离心液全部流于底部，准备跑电泳。7、测595nm吸光度，打开盖预热30min，每次都将空白校正0，读取标准品对照组，样品组的吸光度，尽快。比色皿水洗+酒精洗。8、建Excel：（一）Cx=Ax/A标。C标（C标=10ug/ml,由30ul稀释至40ul,A标已经知道的）（二）一般上样量为：30ug,故:30ug上样量/(0.75Cx)=V上样（ml）由（一）（二），得：V上样=A标/Ax.4二配胶1、提前配板：洗板，吹干，对齐，夹紧（向下压），配分离胶（两块板10ml），灌胶，压水，观察是否漏液，出现分界面，配浓缩胶（两块板4ml），若温度太低不易凝，可将分离胶中10%APS,TEMED同时加倍促凝.将配胶用烧杯洗净干燥，配胶：210％分离胶5％浓缩胶10ml(两快板)15ml(三快板)4ml(l两块板)6ml(三块板)H2O4.0ml5.9ml2.7ml4.1ml30％丙稀酰胺3.3ml5ml670ul1.0Tris-HCL2.5ml（1.5M，Ph8.8）3.8ml0.50ml（1.0M，Ph6.8）0.75ml10％SDS100μl150ul40μl60ul10％APS（聚合剂，现配，灌胶前加入）100μl150ul40μl60ulTEMED（加速剂，灌胶前加入）4μl6ul4μl6ul2、根据板子数计算所需胶的体积数，根据比例配制胶液，为铺胶平整下层胶铺好后立即UP水封，待胶干后倒去上层UP水并用滤纸吸干，按比例配制浓缩胶（积压胶），最后上梳子（注意孔数、厚度与玻璃板搭配）；补液。3、制好胶的玻璃板，仔细观察可以看到一条水平的折线，如若不用，浸泡在电泳液里。三上样及电泳1、电泳液的配制：up水（1000ml）,tris(3.03g),甘氨酸（18.8g）,SDS（1.0g）.2、将两块配好胶的玻璃板薄面相对，夹好（注意对齐，防止漏液），中间倒入电泳液（注意拿错电泳架，分为：有电机的和无电极的），一般两块板的电泳液加到下面的线下面，四块板就加到上面线的刻度下。3、若电泳液不渗漏，即可拔去梳子（注意两边同时用力，平整拔出）。4、按上样量点样，每块板子第一孔为Mark（上样量为8-10ul），后面为样品，不用样品间换枪头。5、将点好样的胶板放入电泳槽，槽内加适量电泳液，注意正负极连接.6、打开开关，调整电压(80V)、电流（250mA）时间(30min)，开始电泳,结束后，调节电压（110V）、时间（60min）。四转膜1、转膜液的配制：up水（800ml）,tris(3.03g),甘氨酸（14.4g）于40C置于冰箱，用时加甲醇200ml（20%）搅拌混匀。（记得用的时候要加啊）2、按海绵大小剪滤纸（上下共8张）、NC膜，放在电泳槽内，使之与转膜液充分浸泡.33、将转膜夹打开，透明面（正极）朝下，上面依次放置：海绵、滤纸（4张）、NC膜、胶带、滤纸(4张)、海绵（胶带与膜之间不要有气泡），然后将黑色面压下，夹好,注意NC膜一直要保持湿润。4、电泳完毕后，将玻璃板拆卸下来，薄板和厚板分离（小心避免撬碎玻璃板）；将带有胶的板子下方衬白色滤纸，读出Mark标记，用绿色小平板撬开玻璃板，将浓缩胶去除，将分离胶切去左上角以标记正反面，将胶放入平皿，平衡30min；根据标记切胶（切割时注意水平），选取含有目的蛋白的胶条（ASIC蛋白分子量72，为兔抗。Actin作内参考43，为鼠抗），切好的蛋白胶条放在转膜液里浸泡一下以减小表面张力，铺胶带时，注意条带的左右顺序，用圆珠笔标记。5、放入4℃冰箱，连接电极，黑对黑，红对红，打开电源，调整电压（300V）、时间（1.5h），开始转膜。(总蛋白：100-130,40-55)六封闭1、配制TBST缓冲液:UP水（996ml）,NacL(8.5g),Tris(6.057g),用盐酸调Ph值至7.5-7.6（4管0.9mlHcl）,最后加Tween20(500ml)，注意Tween20粘稠，将枪头去尖嘴后吸取。2、配制封闭液：一般配制的是BSA(5%):40mlTBST+2.0gBSA,置于塑料器皿或半个牛奶盒中，于摇床摇匀1.0小时。3、一抗孵育：（1）1%的BSA配制：称取0.04gBSA加到装有4mlTBST溶液的4ml小管中。（2）配制一抗缓冲液配制1%的脱脂奶粉与TBST液中（W/V）,按1:200稀释ASICI抗体。(本实验室：1%的BSA：一抗=4ml:1ul，一般每条带2ml).(具体见抗体说明书)（2）用压塑机做塑料袋（先封住相邻两边，每边封两道防漏，尽量撑展），将膜取出移入塑料袋中，标记，正面向上。然后再封住一边，加入一抗缓冲液5ml，排气泡，封最后一边；放在4℃冰箱的摇床上摇动（正面朝上，尽量用最快速度），过夜（一般大于18小时）。（3）剪开塑料袋，将膜取出放入皿中用一定量的TBST洗膜，10min×3次,一抗回收，放入冰箱。4、二抗孵育：4（1）1%的BSA配制：称取0.04gBSA加到装有4mlBTST溶液的4ml小管中。（4）二抗缓冲液的配制：配制1%的脱脂奶粉与TBST液中（W/V）,稀释HRP标记的二抗（GLU用兔抗:1:3000，β-actin用鼠抗：1:3000）(本实验室：1%的BSA：二抗=4ml:1ul，一般每条带2ml).(具体见抗体说明书)（2）用压塑机做塑料袋（先封住相邻两边，每边封两道防漏，尽量撑展），将膜取出移入塑料袋中，标记，正面向上。然后再封住一边，加入二抗缓冲液5ml，排气泡，封最后一边；放在摇床上摇动1.0小时（正面朝上，尽量用最快速度）。（3）剪开塑料袋，将膜取出放入皿中用一定量的TBST洗膜，10min×3次。七化学发光检测1、取出化学发光试剂盒（4℃避光保存），在开启之前平衡至室温。黑白瓶各取2ml，共4ml（要求的体积是膜面积×0.125ml），吹打混匀。垫保鲜膜，将膜正面朝上置于保鲜膜上，加2ml混合的检测试剂于膜上，饭盒盖盖住，室温孵育5min；吸掉发光液，放入化学发光仪（Omega16ic）内检测：化学发光曝光10－15min。2、将WesternBlot产物进行条带灰度分析，用Gel-ProAnalyzer专业分析软件读取IOD值。以目的蛋白的IOD值/内参的IOD值半定量蛋白的水平。结果进行方差分析，以P0.05为具有统计学意义。WesternBlot实验成功完成WesternBlot检测，必须满足4个条件：（1）凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析（2）吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析（3）处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上（4）处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性5内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果WB检测基本过程1、获取细胞或组织裂解物1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：蛋白位置推荐buffer全细胞NP-40orRIPA胞浆（可溶性蛋白）Tris-HCl胞浆（骨架结合蛋白）Tris-Triton膜蛋白NP-40orRIPA核蛋白RIPAor核蛋白提取试剂盒线粒体蛋白RIPAor线粒体分离试剂盒亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！2、蛋白定量常用的蛋白定量方法：Bradfordassay,Lowryassay或BCAassay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C/-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白3、电泳分离蛋白质根据待测蛋白状态确定电泳条件：待测蛋白状态凝胶条件上样buffer电泳bufferReduced-Denatured还原，变性含β-巯基乙醇或DTT，含SDS含SDSReduced-Native还原，不变性含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS不含SDSOxidized-Denatured不还原，变性不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS含SDSOxidized-Native不还原，不变性不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS不含SDS根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度6蛋白分子量（kDa）凝胶浓度（％）4-402012-451510-7012.515-1001025-20084、转膜根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：PVDF膜NC膜尼龙膜灵敏度和分辨率高高高背景低低较高蛋白结合能力100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）80-100ug/cm2400ug/cm2机械强度强干的膜易脆软而结实溶剂抗性强差差使用前是否需要浸润100%甲醛润湿缓冲液润湿缓冲液润湿适用染色方法胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁不能用阴离子染料适用检测方法显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测显色法、化学发光、荧光、放射性显色、化学发光、放射性适用范围普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用价格高较低低5、封闭7去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS6、一抗孵育一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体一抗的保存和使用：根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:100-1:3000）。孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别内参