Western-Blot-操作要点

STANDARDOPERATINGPROCEDURE(SOP)ISSUEDBY制订人范翠翠REG.No.登记号Page页1(2)TRANSLATEDBY翻译人TRANSLATIONAPPROVEDBY翻译批准APPROVEDBY批准人Approveddate批准日期Validfrom生效日期CopyNo.复印号Toberevised下次修改日期SupersededREGno.前登记号SUBJECT/题目周玉坤WesternBlot技术服务项目HEADING/标题TEXT/内容Content1.Objective2.Scope3.MaterialsReagentsInstrumentConsumable4.Procedure5.ChanginghistorySTANDARDOPERATINGPROCEDURE(SOP)ISSUEDBY制订Approvedby批准REG.No.登记号)Page页2(12)HEADING/标题TEXT/内容1．Objective－鉴定蛋白表达情况－2.Scope－－本SOP适用于Western-Blot试验操作3．Procedure仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/LPBS(pH7.3)、12％分离胶、5％浓缩校、2XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、一抗（由委托人提供）、HRP-羊抗鼠二抗、HRP-羊抗兔二抗、ECL化学发光试剂、显影液、定影液。杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；PVDF膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：1.0mol/LTris·HClTris(MW121.14)30.29g蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。PHHCl7.4约17ml7.5约16m7.6约15ml8.0约10ml10％SDSSDS10g蒸馏水至100ml50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。STANDARDOPERATINGPROCEDURE(SOP)ISSUEDBY(iss.Dep./name)制订Approvedby批准REG.No.登记号Page页3(12)HEADING/标题TEXT/内容01-010-0110％过硫酸胺（APS）过硫酸胺0.1g超纯水1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)45.43g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）Tris(MW121.14)15.14g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。30％Acr丙稀酰胺（Acr）29g甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g超纯水至100ml溶解后，0.45μm滤膜过滤后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）Na2HPO42.9gKH2PO40.2gNaCl8gKCl0.2gSTANDARDOPERATINGPROCEDURE(SOP)ISSUEDBY(iss.Dep./name)制订Approvedby批准REG.No.登记号Page页4(12)HEADING/标题TEXT/内容01-010-01蒸馏水至1000ml12％分离胶和5％浓缩校10mL12％分离4mL5％浓缩胶超纯水3.3ml2.7ml30％Acr4.0ml0.67ml1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）2.5ml－1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）－0.5ml10％SDS100l40l10%AP（过硫酸胺）100l40lTEMED4l4l加TEMED后，立即混匀即可灌胶。还原型2XSDS上样缓冲液1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）0.5mlSDS0.2g溴酚蓝10mg甘油1.0mLDTT，MW154.5）0.39g临用前取1.0mol/L贮存液DTT1.0mL加入4.0mL2XSDSloadingbuffer，混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存,一周内用完。DTTDTT5.0gDDW32.4Ml分成小份，-20度保存。5*Tris-GlycineBuffer电泳液缓冲液Tris（MW121.14）15.1gSTANDARDOPERATINGPROCEDURE(SOP)ISSUEDBY(iss.Dep./name)制订Approvedby批准REG.No.登记号Page页5(12)HEADING/标题TEXT/内容01-010-01甘氨酸（MW75.07）94gSDS5.0g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。10*转移缓冲液甘氨酸（MW75.07）14.5gTris（MW121.14）29gSDS0.5g蒸馏水至500ml溶解后室温保存，临用前取200mL甲醇加入800mL转膜缓冲液中共1000mL。次溶液可重复使用3～5次。TBS缓冲液1mol/LTris·HCl（pH7.5）10mlNaCl8.8g蒸馏水至1000mlTBST缓冲液（含Tween20的TBS缓冲液）0.05％Tween200.25mlTBS500ml混匀后即可使用，最好现用现配。1*TBST1LTrisbase2.422g(MW121.4)Nacl8.775gTween200.5ml封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌）5gSTANDARDOPERATINGPROCEDURE(SOP)ISSUEDBY(iss.Dep./name)制订Approvedby批准REG.No.登记号Page页6(12)HEADING/标题TEXT/内容01-010-01TBST100mL溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。显影液一小袋溶于250mLDDW中，棕色瓶保存。定影液一盒溶于1000mLDDW，室温棕色瓶保存。抗体用封闭液稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml。ECL化学发光试剂购自碧云天，分A和B两种试剂。操作步骤：（一）SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（2）灌胶与上样1玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）2按前面方法配12％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）3当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水STANDARDOPERATINGPROCEDURE(SOP)ISSUEDBY(iss.Dep./name)制订Approvedby批准REG.No.登记号Page页7(12)HEADING/标题TEXT/内容01-010-01吸干。4按前面方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。5用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）6测完蛋白含量后，计算含50g蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15l，加样孔的最大限度可加20l样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。7加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。（3）电泳电泳时间一般4～5h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。（二）转膜（1）转一张膜需准备2张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸STANDARDOPERATINGPROCEDURE(SOP)ISSUEDBY(iss.Dep./name)制订Approvedby批准REG.No.登记号Page页8(12)HEADING/标题TEXT/内容01-010-01纤维素膜置于转膜缓冲液中浸15min才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫一层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2h或40V转移3h。STANDARDOPERATINGPROCEDURE(SOP)ISSUEDBY(iss.Dep./name)制订Approvedby批准REG.No.登记号Page页9(12)HEADING/标题TEXT/内容01-010-01（6）转完后将膜取出，可以看到预染Marker已经转印到膜上了，这个过程要保证膜的湿润，不能干燥，否则会产生较强的非特异性。膜一：膜二：1Occluding65kD2ZO-1220kD3Claudin-122kD4Claudin-422kD5JAM-A36-41kDA1B1C1D1A2B2C2D2A3B3C3D3120kD86kD47kD36kD26kD20kD1253120kD86kD47kD36kD26kD20kDA1B1C1D1A2B2C2D2A3B3C3D3476STANDARDOPERATINGPROCEDURE(SOP)ISSUEDBY(iss.Dep./name)制订Approvedby批准REG.No.登记号Page页10(12)HEADING/标题TEXT/内容01-01