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课题3血红蛋白的提取和分离本课题学习目标体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点：①样品的处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：1、含量2、组成元素3、相对分子质量4、基本组成单位：结构通式：种类：5、氨基酸连接方式占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物C、H、O、N(大多数含S)高分子化合物氨基酸RHCCOOHNH2脱水缩合知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：6、肽键结构式：7、形成方式8、蛋白质多样性的直接原因：(根本原因？)9、蛋白质的鉴定方法氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（n条）细胞和生物体的结构物质，是一切生命活动的主要承担者。CONH氨基酸的种类、数目、排列顺序不同；多肽链的空间结构不同。10、生理功能DNA的多样性根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。问：依据什么来分离和提取蛋白质基础知识阅读并回答（P64）1、凝胶色谱法另一个名称；2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据；3、凝胶的实质；4、凝胶色谱法的原理。基础知识（一）凝胶色谱法1、别名：是根据，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用分离蛋白质的有效方法。3、凝胶①性质：一些微小的，球内含许多贯穿的通道；②化学本质：③实例：（一）凝胶色谱法2、依据的特性:分配色谱法相对分子质量的大小蛋白质相对分子质量的大小多孔球体多糖类化合物葡聚糖、琼脂糖当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。较小较大凝胶外部较短较快分离出的蛋白质。相对分子质量较大原理：（一）凝胶色谱法4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示1、缓冲物质有哪些？2、缓冲溶液的作用是什么？3、怎样配制缓冲溶液？（二）缓冲溶液1、缓冲溶液概念在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变。2、缓冲溶液作用基础知识（二）缓冲溶液3、缓冲溶液配制通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）1、概念：带电粒子在的作用下发生迁移的过程。电场2、原理：许多重要的生物大分子，如等都具有，在下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其移动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身、的不同使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电一定的PH所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度(三)电泳3、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量琼脂糖凝胶电泳示意图在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳实验操作阅读课本66页-67页相关内容，思考以下问题：1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？2、洗涤红细胞的目的是什么？怎样洗涤？洗涤干净的标志是什么？3、采用什么方法分离血红蛋白？离心分层后，各层的成分各是什么？用滤纸过滤，去掉什么成分？4、透析目的？实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。1、人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；猪牛羊（哺乳动物）成熟的红细胞无细胞核，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。血液血浆血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）2、血液有哪些成分？1、红细胞的洗涤（1）洗涤的目的：（2）洗涤方法：（3）洗涤干净的标志：除去杂蛋白（血浆蛋白）上清液不再呈现黄色。（一）样品处理生理盐水2、血红蛋白的释放在和的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。1、红细胞的洗涤（一）样品处理蒸馏水甲苯3、分离血红蛋白溶液（1）方法：离心（2）离心分层后，各层的成分甲苯层（3）滤纸过滤，除去，于分液漏斗静置片刻，分出下层的。脂溶性沉淀层脂溶性沉淀层红色透明液体取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。4.透析问：透析过程及透析目的？透析目的是：除去样品中分子量较小的杂质。说明：透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大分子不能通过。（二）粗分离4.透析实验操作（二）粗分离阅读课本P67-69，了解凝胶色谱的操作过程。实验操作（二）凝胶色谱操作1、凝胶色谱柱的制作2、凝胶色谱柱的装填3、样品的加入和洗脱2.实验操作(1)样品处理：通过红细胞的洗涤、、等操作收集到血红蛋白溶液。(2)粗分离：通过透析去除血红蛋白溶液中的较小的杂质。(3)纯化：通过分离相对分子质量不同的蛋白质。(4)纯度鉴定：用进行样品纯度鉴定。搅拌离心相对分子质量凝胶色谱法SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA粗提取与血红蛋白提取的比较提取物质DNA血红蛋白提取方法盐析法凝胶色谱法、电泳法提取原理①DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同②DNA不溶于酒精，但某些蛋白质则溶于酒精①根据相对分子质量的大小②各种分子带电性质差异步骤①溶解在2mol/L的NaCl溶液中②加水稀释至0.14mol/LNaCl溶液使DNA析出过滤③2mol/LNaCl溶解④加入冷却酒精析出①样品处理②粗提取③纯化④纯度鉴定练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法比较3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A调节pHB维持红细胞的能量供应C防止微生物生长D防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的O2分子数或者CO2分子数分别是A4、2B4、4C2、1D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀