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实验七直接抗人球蛋白试验第一部分直接抗人球蛋白试验原理直接抗人球蛋白试验原理：直接抗人球蛋白试验是检测红细胞在体内是否被不完全抗体致敏的实验。若红细胞在体内已被不完全抗体所致敏，加入的抗人球蛋白则可与红细胞表面不完全抗体结合使红细胞相互连接起来出现凝集现象。——直接抗人球蛋白试验阳性致敏红细胞抗人球蛋白直接抗人球蛋白试验抗球蛋白试剂通常有三种：多特异性抗球蛋白试剂，简称多抗，多抗包括了抗-IgG和抗-C3两种成分，在直抗试验中常常作为初筛试剂使用。单特异性抗-IgG试剂，简称抗-IgG单特异性抗-C3试剂，简称抗-C3在直抗试验中一旦出现阳性结果，通常需要抗-IgG和抗-C3进一步分析。直接抗人球蛋白试验临床意义检测体内红细胞是否被不完全抗体或补体致敏,可用于：1）新生儿溶血病胎（婴）儿致敏红细胞检测2）自身免疫溶血性贫血的诊断3）溶血性输血反应的研究第二部分直接抗人球蛋白试验操作直接抗人球蛋白试验难点：难以获取致敏红细胞标本？解决方案：试剂红细胞+IgG抗D血清（人工致敏RBC)受检标本红细胞悬液配制：1.抗凝全血2ml（与抗凝剂混匀）1000g离心3min分离上层血浆2.压积红细胞的制备：NS洗涤三次，注意离心速度及时间（1000g离心1min）（注意操作轻柔，防溶血！）3.取压积红细胞配成5％的红细胞悬液（1d压积红细胞＋19dNS）人工制备IgG型致敏红细胞（阳性对照）：1、采集3人份O型RhD阳性抗凝全血，1000g离心3min，分离血浆；红细胞经生理盐水（NS）3次洗涤后，取3人份的压积红细胞各5滴混匀，备用；2、用一次性吸管取压积红细胞3滴于试管中，加入2倍体积的单克隆IgG抗D血清，混匀，置于37℃孵育45min；3、孵育结束取出试管，1000g离心2min，弃上清，用2倍体积的NS洗涤3次（1000g离心1min），最后加入NS配制成约5％的致敏红细胞悬液（1d压积红细胞＋19dNS），备用未致敏红细胞（阴性对照）：取3滴3人份混合压积红细胞，加入57滴NS混匀，备用。（无须单克隆IgG抗D血清致敏）标记3支试管，分别为待检管、阴性对照和阳性对照。按下表加入各反应物：反应物待检管阴性对照阳性对照5％待检标本RBC15％阴性对照RBC15％阳性对照RBC1多特异性抗球蛋白试剂111受检者标本检测混匀，1000g离心15s，观察凝集反应，记录结果。如果使用的是多特异性抗球蛋白试剂或抗C3抗球蛋白试剂，将未出现反应的试管置室温孵育5min，再离心，观察凝集。实验结果阴性时，应按照试剂说明书要求验证阴性结果的正确性。加1滴IgG致敏5％红细胞悬液于未出现凝集的试管中，1000g离心15s，观察凝集，记录结果。受检者标本检测如阳性对照凝集，阴性对照不凝集，受检RBC凝集者直接抗球蛋白试验为阳性，不凝集者为阴性。结果判定标本采集后应尽快进行试验，试验延迟或中途停止可能使抗体从细胞上释放出来。待检红细胞一定要用盐水洗涤至少3次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。离心时间和离心力要按标准操作。若果要了解在体内致敏红细胞的免疫球蛋白类型，则可分别以抗IgG、抗IgM或抗C3单特异性抗球蛋白试剂进行试验。红细胞上若抗体吸附较少，自身免疫性溶血性贫血直接抗球蛋白试验可呈阴性反应。全凝集、冷凝集血标本或脐血标本，试验前应充分洗涤，否则产生假阳性。注意事项实验重点掌握：直接抗人球蛋白试验的原理及临床意义