螺旋藻藻蓝蛋白的分离

螺旋藻藻蓝蛋白的分离摘要:藻蓝蛋白(Phycocyanin)是一个具有生物活性功能的天然蓝色素蛋白,已被用作优质蛋白源,添加于食品和鱼饵料中,具有抗氧化、增强人体免疫力等功能,又可制成荧光探针,用于免疫学、细胞生物学等领域。本文主要介绍运用硫酸铵盐析与层析柱结合法从螺旋藻中分离提取藻蓝蛋白。藻蓝蛋白是一类普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素,一种特殊的色素蛋白,由开链四吡咯化合物和脱辅蛋白通过硫链键结合。藻蓝蛋白在螺旋藻中的含量高达10%～20%,是螺旋藻细胞中重要的光合作用的天然色素,在光合作用中能以近乎100%的高效率把光能优先地传递给光系统。藻蓝蛋白既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业。同时藻蓝蛋白具有强烈荧光可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物质等,用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中。同时藻蓝蛋白还是一种无毒副作用的理想光敏剂。由于藻蓝蛋白具有良好的开发前景,在螺旋藻的含量较高,螺旋藻中藻蓝蛋白的研究成了藻类蛋白研究的热点。1工艺流程弃去下层墨绿色沉淀↗螺旋藻（加入提取液）→冻融→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入↗弃去蓝色沉淀(NH4)2SO4固体粉末（在溶液浓度达到20%）→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入(NH4)2SO4固体粉末（在浓度达到50％）→离心（10000r/min,15min）→取得深蓝色沉淀→加入蒸馏水→装入层析袋→蒸馏水中层析（4℃）→过柱纯化→结果检测↘弃去黄绿色上清液2分离纯化具体方法2.1取螺旋藻粉颗粒倒入塑料瓶中，加提取液。2.2.将塑料瓶用滤纸封住瓶口置低温（－20℃）下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。如此反复冻融多次（实验中此步骤我们只做了一次，其余由老师帮做）,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。实验现象:解冻前:墨绿色固状(略带紫色)解冻后:墨绿色溶液2.3.冻融所得溶液分两次在10000rpm下高速离心15min，得到亮蓝色上清液，用小烧杯收集，弃去下层墨绿色沉淀。2.4.称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4浓度达到20％。在10000rpm下高速离心15min，离心沉降后，取得亮蓝色上清液，弃去蓝色沉淀。2.5.称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4浓度达到50％。在10000rpm下高速离心15min，离心沉降后，取得深蓝色沉淀，弃去黄绿色上清液。加适量蒸馏水溶解所得沉淀备用(水因尽量少,有利于渗析)。2.6.剪取约25cm长的层析袋，放入烧杯中煮沸5min（从水沸开始计时），将其中一头用细线扎住，对折后再用细线扎住。将之前溶解沉淀的溶液倒入层析袋中。放入蒸馏水中，4℃下透析2—3天。2.7.取一支层析柱，检漏后清洗干净，用两个铁夹固定在铁架台上，要从正面和侧面检查是否竖直，如不竖直则作出调整。称取40gDEAE—纤维素—52于一烧杯，加150ml0.5MHCL溶液，轻搅,浸20min，小心倒掉上清液，补水到同一刻度，轻轻搅拌溶液，均匀地倒入柱中。柱中液面上要保留2～3cm的空间，之后液面每下移到原刻度位置，就补水到相应高度，使蒸馏水始终高于填料2cm以上。2.8.剪一片刚好可以覆盖填料平面的滤纸，轻放入填料面。将准备好的层析柱中的缓冲液放出，待液面比填料高出大约只有1cm时，关闭柱开关。用胶头滴管吸取透析后的藻蓝蛋白粗提液，伸入柱液面内，沿管壁以很慢的速度将粗提液滴到液面中部，待液面升高后可以加快滴加速度。待液面离柱口只有大约2cm距离时，把开关完全打开，一边继续滴加粗提液。现象：开始有颜色分层，由上到下分别为蓝色，绿色，黄色2.9.待粗提液液面比填料高出大约只有1cm时，滴加50ml，0.02M，pH6.5磷酸缓冲液冲洗残余粗提液，不要一次加入，应先加少量把残余粗提液冲洗干净(至溶液澄清为止)，再大量加入。最后加入0.5MNaCL—0.02M，Ph6.5磷酸缓冲液（流速：1.0ml/min）。第一次洗脱后现象：洗脱一段时间后出现红色层，最后出现明显的四个分层，由上到下分别为蓝色，绿色，青色，粉红色。2.10.小心观测，待有浅蓝色溶液流出时，马上开始收集。2.11.结果检测3结论目前，螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，由于受其溶解性质的局限性，使其应用受到一定的限制螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻,因含有多种对人体有益的营养物质而受到广泛的关注,其突出特点是氨基酸种类齐全且蛋白质含量高,其中含量最高的藻蓝蛋白(PC)一直是基础研究的热点,不仅在光合作用的原初反应机理的探索方面有重要意义,而且可以作为生物体内的荧光示踪物质,作为天然的色素蛋白也具有十分广阔的应用前景。但由于藻蓝蛋白分离纯化的困难,普及化有难度。目前主要研究在于简化分离提纯的工艺流程，节约成本，解决普及化。参考文献：[1]胡一兵,胡鸿钧,李夜光,等.从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝蛋白的研究[J].武汉植物学研究,2002[2]王勇,董强,钱凯先.高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究[J].生物化学与生物物理进展,1999[3]殷钢,刘铮,刘飞,钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究3清华大学学报(自然科学版)1999年第39卷第6期[4]徐长波,王巍杰,螺旋藻藻蓝蛋白的分离纯化研究进展,山东化工2009年第38卷[5]GEAMechanicalEquipment/GEAWestfaliaSeparatorGroup,SeparationTechnologyforAlgaeProduction[6]ExtractionandPartiallyPurificationofNaturalPigmentsfromSpirulinaplatensis