放射免疫分析

体外放射分析山西医科医科大学第一医院核医学科定义：全称体外放射配体结合分析---指在体外条件下，以放射性核素标记的配体为示踪剂，以结合反应为基础，以放射性测量为定量手段，对微量活性物质进行定量分析的一类检测技术的总称。配体---能与结构上某一部位起互补结合的分子或化合物，如抗体、抗原，受体、蛋白激素基本定义抗原的概念抗原（antigen,Ag)：是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质。抗原的两种特性：免疫原性和抗原性免疫原性（immunogenicity),能刺激机体发生免疫应答，产生抗体和致敏淋巴细胞的能力。抗原性（antigenicity),能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。基本定义基本定义半抗原---分子量小于5000的肽类，需与载体蛋白结合才能引起免疫应答.抗体（Antibody,Ab）是由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类能和相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。主要内容一.概述基本试剂基本原理操作过程分离技术质量控制三．免疫放射分析（IRMA）四.非放射性标记免疫分析技术酶免疫分析（EIA）化学发光免疫分析（CLIA）时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）二.放射免疫分析（RIA）1.历史回顾1959年Berson、Yalow开创了放射免疫分析。于1977年荣获诺贝尔生物医学奖。1960年Ekins建立了竞争蛋白结合分析法。1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析。近年来化学发光、电子化学发光、荧光时间分辨等非放射性标记免疫分析自动化技术先后问世，检测灵敏度提高到了10–15g。概述2.类型：（据特异性结合试剂的不同分类）放射免疫分析（RIA）1959竞争性蛋白结合分析（CPBA）1963免疫放射分析（IRMA）1968放射受体分析（RRA）70年代放射酶学分析70年代放射微生物分析概述其他非放射性标记免疫分析：酶免疫分析（EIA）化学发光免疫分析（CLIA）荧光免疫分析（FIA）时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）颗粒计数免疫分析（PACIA）……概述主要内容一.概述基本试剂基本原理操作过程分离技术质量控制三．免疫放射分析（IRMA）四.非放射性标记免疫分析技术酶免疫分析（EIA）化学发光免疫分析（CLIA）时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）二.放射免疫分析（RIA）放射免疫分析（RIA)（RadioimmunoassayRIA）基本试剂基本原理操作过程分离技术质量控制RIA主要内容♣♣♣♣♣♣RIA定义是利用标记抗原和非标记抗原竞争结合其特异抗体，给予充分的时间，使反应达到平衡，然后分离并分别测定结合的抗原抗体复合物放射性（B）和游离抗原放射性（F）来计算出非标记抗原含量的一种超微量分析技术。♣♣♣♣♣♣RIA基本试剂1、标记抗原125I多数γ闪价廉3H少数液闪费用高*Ag的质量要求：标记后不改变原有抗原的生物活性；标记的放射性核素的t1/2不能太短；比活度和放化纯度足够高，保证分析的灵敏度。125I的特性：碘元素共有29种同位素，其中23种放射性核素，125I最为常用，优点：半衰期适中（60天），易于商品化和储存，也利于废物处理；只发射28keVχ线和35keVγ射线（无β），容易测量，辐射自分解少，标记物足够稳定；化学性质活泼，标记容易，可得到多种标记物而广泛应用。2、标准抗原（标准品）是已知含量并呈梯度浓度的系列标准抗原，作标准曲线用。要求：保证与被测物具有相同的免疫活性和相同介质。RIA基本试剂3、抗体RIA使用：多克隆抗体单克隆抗体RIA基本试剂衡量抗体质量的指标是：亲和力:抗体结合的强度特异性:不受交叉反应物质影响的程度滴度:抗体的效价——抗体实际应用时的稀释倍数，滴度越高，所需的抗血清量越少，血清的稀释倍数越高，抗血清中杂质干扰也少。一般滴度高到1：1000以上，血清中干扰物质影响就很小。RIA基本原理最具代表性的一类检测技术，是建立在抗原抗体结合的高度特异性和放射性测量的高度灵敏性的基础上的。Ag＋AbAgAb＋*Ag*AgAb动态平衡体系中，*Ag与Ag具有同样的免疫活性和结合反应能力，当*Ag和Ab的量恒定，且Ag+*Ag的分子数〉抗体的分子数，*Ag与Ag相互竞争同Ab结合，彼此抑制，待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系。Ag*AgAbBoundFreeBFB/F0.670.3310.500.5020.50.330.670.20.170.83竞争放射分析原理示意图05101520B/F2.52.01.51.00.50.0剂量-标准抗原浓度剂量-标准抗原浓度051015B/B0%100500待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系RIA操作过程配制已知浓度系列标准抗原（Ag）---现多由厂家提供已配置好的标准品加待测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育加标记抗原（*Ag）和抗体（Ab）--温育分离复合物*AgAb（B）和游离*Ag（F）用γ计数器测量放射性计数根据标准曲线或计算机直接算出1.样品或标准品2.标记物3.抗血清混匀温浴分离剂混匀立即1.加样2.加分离剂3.离心4.去上清分离5.测量RIA分离技术目的：将游离*Ag和*AgAb有效分离。小分子大分子活性炭吸附法聚乙二醇双抗体法沉淀法葡萄球菌A蛋白固相法Ab聚乙二醇即PEG沉淀法——能促使AgAb沉淀。双抗体法抗体与抗原反应结束后，加入第一抗体的抗体（即第二抗体），形成抗原-第一抗体-第二抗体复合物，易于沉淀，用PEG法增加分离效果。葡萄球菌A蛋白能促使AgAb沉淀，效果较好。活性炭吸附法活性炭能吸附小分子的游离抗原，离心后的复合物留在上清液中，游离抗原沉在沉淀中。特点：易于解离，须严格掌握时间和温度。葡聚糖包被活性炭（DCC）--能增加吸附效果和减少解离。固相法抗体吸附固体支持物或反映试管上常用的固体支持物：◘塑料（聚乙烯、聚苯乙烯、尼龙）◘纤维素◘凝胶颗粒（葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺）◘多孔玻璃微球部分游离抗原未被洗净---沉淀法和固相法分离剂质量差或量不足分离效果差的原因RIA质量控制目的：保证分析误差控制在可接受的范围内分类：实验室内部质控实验室间质控系统误差表现为结果呈倾向性偏高或偏低。常见因素①方法误差：如标准品稀释不正确，分离效果不好等②仪器和试剂：仪器状态、量器、试剂纯度等③操作误差：操作习惯、加错样品等。通过努力系统误差可以消除。随机误差表现为某一管或某一部分样本的结果误差随机的、偶然的，小误差的概率大。常由操作者操作不当造成。误差的来源：质量控制的指标1、稳定性2、精密度3、灵敏度4、准确度1、稳定性：指RIA实验批间的重复性。常用指标：零标准管结合率（B0%）:没有待测物时，标记抗原与抗体之间能产生的最大结合率（一般要求在30-50%）非特异性结合率（NSB%）：没有结合剂（抗体）的存在下，标记配体（抗原）被分离试剂结合造成的结合率，（一般要求5-10%）标准曲线直线回归的参数截矩a---稳定斜率b---稳定相关系数r99%ED25、ED50、ED75即标准曲线在25%、50%、75%时横坐标上对应的抗原浓度值。反映标准曲线的稳定性。2、精密度：是对某一样品多次检测所得结果的符合程度。即复管的重复性。是最重要的质量参数。3、灵敏度：方法的最小可测值。计算方法是累计多批（一般10次）测量结果，计算出零标准管的结合率为x－2SD时对应的剂量值。4、准确度：是指测量值与真值的接近程度，评价方法：回收率：是反应测定值偏差的质控指标。对照管加入待测样品，回收管加入待测样品和已知量的标准品，两者实测结果相减即为外加标准品的实测含量。要求：接近100%，且变异小。质控样品：含有一种或几种测定物，其量值是经过标定的靶值，用来比较和评价测定系统的偏离和重复性的实验用血清。一般有高中低三种类型，衡量该批分析结果的准确度。健全性：用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一致。用样本稀释曲线与标准曲线的平行度来判断。准确性和精密性如同打靶精确度好偏差小偏差小精确度差精确度好偏差大偏差大精确度差精确性问题是随机误差问题，而偏差是系统误差问题RIA手工操作的质控难题数十、百次加样的“移液误差”由分离技术带来的“错分误差”由样本量大所致的“漂移误差”测定的精度“取决”于工作人员的状态RIA的特点：灵敏度高示踪高灵敏可达10-9～10-12g特异性强免疫学反应，抗体为结合试剂特异结合的三维结合的位点精确度好方法的稳定性好应用广泛缺陷---造成放射免疫难以进行全自动化分析RIA面临挑战半衰期短（受125IT1/2的限制），药盒使用寿命一般不超过2个月；由于标记物的不断变化，带来药盒批间、批内较大的差异，标准曲线必须同批有效；为了达到有效的质量控制，样本须做复管测定；放射性测量有统计涨落，依靠时间累计，至少计数1min；反应时间过长（数小时甚至过夜）。真正使放免面临挑战的是20世纪90年代兴起的全自动化标记免疫分析的问世。这种方法、仪器、试剂三位一体的特定分析系统有效地解决了大规模临床样本检测的稳定、高效、快速、自动化问题。是医学超微量分析的一次战略性革命。一.概述二.放射免疫分析（RIA）基本试剂基本原理操作过程分离技术质量控制四.非放射性标记免疫分析技术酶免疫分析（EIA）化学发光免疫分析（CLIA）时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）三．免疫放射分析（IRMA）免疫放射分析（IRMA）IRMA定义是以125I标记抗体，用过量的标记抗体与待测抗原形成复合物，分离除去多余的游离抗体，测量抗原抗体复合物的放射性。Ag＋*AbAg*AbIRMA基本原理与RIA的不同：放射性标记的是抗体而不是抗原,且抗原与过量的标记抗体结合反应,故反应是非竞争性的全量反应。IRMA与RIA的工作原理的主要区别项目RIAIRMA反应机制竞争性反应非竞争性全量反应灵敏度提高（10-100倍）主要反应试剂三种标记抗原二种标记抗体分离方法抗原只需一个抗原决定簇一般需单抗作分离剂，抗原需两个或两个以上决定簇待测抗原复合物放射性与待测抗原呈负相关与待测抗原呈正相关非特异性结合主要影响高剂量反应主要影响低剂量反应结合率（%）Ag剂量RIAIRMA和RIA曲线形态比较结合率（%）Ag剂量IRMAIRMA法分类双抗体夹心法：采用了固相抗体法标记第三抗体法：第三抗体即夹心法中的标记抗体的抗体（双抗）标记三抗作为通用示踪剂，可用于多种待测抗原的分析。抗体抗原过量标记的抗体IRMA局限性至少需要两个抗体；对缓冲液PH及离子强度的要求较为严格；待测抗原的量太大时，易出现“倒钩”现象。一.概述二.放射免疫分析（RIA）基本试剂基本原理操作过程分离技术质量控制酶免疫分析（EIA）化学发光免疫分析（CLIA）时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）三．免疫放射分析（IRMA）四.非放射性标记免疫分析技术非放射性标记免疫分析技术分类酶标免疫分析（酶免疫发光、酶免疫荧光、酶免疫发光）发光免疫分析（化学发光、酶放大发光、电化学发光）荧光免疫分析（荧光偏振免疫、时间分辨荧光免疫分析）颗粒计数免疫分析……一、酶免疫分析技术定义：酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体分子，利用酶促作用使底物反应，利用酶使底物显色的作用而使酶的作用得到放大，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。最常用：酶联免疫吸附分析法（ELISA）常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP）常用的底物：四甲基联苯胺（TMB)，反应后显黄色氨基水杨酸（5-AS），棕色……常用方法：固相测定法测定方式：分光光度计化学发光酶免疫测定（CLIEA）：不同之处是酶反应所用底物为发光剂。用能产生化学发光的化合物代替放射性标记物发光化合物：异鲁米