PCR原理聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR这项技术,被广泛地运用在医学和生物学的实验室,例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定。DNA变性DNAdenaturation:加热或用碱处理双链DNA,使氢链断裂,结果DNA变成为单链,此称为DNA的变性。发生这种变化时的温度称为融解温度,鸟嘌呤和胞嘧啶含量高的DNA融解温度也高。由于变性的结果DNA的紫外线吸收增加,比旋光度和粘度降低,密度也增加。如果在加热后慢慢冷却,则DNA可以再次恢复成双螺旋结构。另外,外部压力也能使DNA变性.PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。引物(primer),是一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点,在核酸合成反应时,作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链,在引物的3′-OH上,核苷酸以二酯链形式进行合成,因此引物的3′-OH,必须是游离的。DNA聚合酶(DNApolymerase)是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA为复制模板,从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性。dNTP:deoxy-ribonucleosidetriphosphate(三磷酸脱氧核糖核苷)的缩写。是dATP,dGTP,dTTP,dCTP的统称。在生物DNA合成,以及PCR聚合酶链反应中起原料作用。由等摩尔数的dATP、dTTP、dGTP和dCTP混合而成。PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。DNA的复性指变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。寡核苷酸:是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸),寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接,所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构,经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。寡核苷酸合成的DNA(脱氧核糖核酸)可以用于链聚合反应,能放大确定几乎所有DNA的片段,在这个过程中寡核苷酸是作为引物,和DNA中标的的互补片段结合,作成DNA的复制品。调控寡核苷酸用于抑制RNA片段,防止其翻译成蛋白,在制止癌细胞活动方面能起一定的作用。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。碱基互补配对原则theprincipleofcomplementarybasepairing在DNA分子结构中,由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变,使得碱基配对必须遵循一定的规律,这就是Adenine(A,腺嘌呤)一定与Thymine(T,胸腺嘧啶)配对,Guanine(G,鸟嘌呤)一定与Cytosine(C,胞嘧啶)配对,反之亦然。碱基间的这种一一对应的关系叫做碱基互补配对原则。DNA半保留复制是:DNA在进行复制的时候链间氢键断裂,双链解旋分开,每条链作为模板在其上合成互补链,经过一系列酶(DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等)的作用生成两个新的DNA分子。子代DNA分子其中的一条链来自亲代DNA,另一条链是新合成的,这种方式称半保留复制。摘要:类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝.PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升.反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算.Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数.平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值.反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素.大多数情况下,平台期的到来是不可避免的.PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间,是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3’端开始延伸,其5’端是固定的,3’端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”.进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合.引物在与新链结合时,由于新链模板的5’端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”.不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用.标准的PCR反应体系:10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10~100pmol模板DNA0.1~2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增.RT-PCR技术概述RT-PCR为反转录PCR(reversetranscriptionPCR)和实时PCR(realtimePCR)共同的缩写。逆转录PCR,或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。1逆转录PCR由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”,由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后,DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成,随每个循环倍增,即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解,留下互补DNA。cDNA是互补脱氧核糖核酸,是与RNA链互补的单链DNA,以其RNA为模板,在适当引物的存在下,由RNA与DNA进行一定条件下合成的。DNA(Deoxyribonucleicacid),中文译名为脱氧核糖核酸,是染色体的主要化学成分,同时也是基因组成的,有时被称为“遗传微粒”。MessengerRNA(mRNA)——信使核糖核酸:携带遗传信息,在蛋白质合成时充当模板的RNA。从脱氧核糖核酸(DNA)转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸(RNA)。它在核糖体上作为蛋白质合成的模板,决定肽链的氨基酸排列顺序。mRNA存在于原核生物和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器(如线粒体和叶绿体)中。cDNA互补脱氧核糖核酸:为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementaryDNA之缩写,或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA,以其RNA为模板,在适当引物的存在下,由依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的作用而合成,并且在合成单链cDNA后,在用碱处理除去与其对应的RNA以后,以单链cDNA为模板,由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA,在遗传工程方面广为应用。在这种情况下,mRNA的cDNA,与原来基因的DNA(基因组DNA,genomicDNA)不同而无内含子;相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上,与exon序列、先导序列以及续序列等一起反映出mRNA结构。cDNA同样可以被克隆。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种RNA的含量。(检测基因表达的方法,参见NorthernBlot法。RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录,要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种,即鸟类成髓细胞性白细胞病毒(avianmyeloblastosisvirus,AMV)反转录酶和莫罗尼鼠类白血