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HIV抗体检测技术湖北省十堰市太和医院检验部胡秀学艾滋病诊断的特殊性高度依赖实验室诊断HIV检测的严肃性：保证输血、器官移植的安全错误结果将导致严重的法律问题结果严格保密艾滋病病毒的形态HIV的逆转录酶缺乏3’—5’核酸外切酶活性，无法修复逆转录和复制过程中发生的错误。HIV颗粒艾滋病病毒的结构HIV生活周期吸附－穿入－脱壳－生物合成－组装成熟和释放HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受体结合HIV感染后的血清学改变诊断：确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。监测：了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。血液筛查：防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。HIV抗体检测目的筛查试验初筛复检确证试验HIV抗体检测程序筛查试验筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。HIV抗体筛查样品血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液。筛查方法酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光或免疫荧光试验（CLIA）：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。快速检测（RT）及其它检测试验(1)明胶颗粒凝集试验(PA)(2)斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验(3)免疫层析试验HIV抗体筛查试验初筛试验对呈阴性反应的样品，可出具HIV抗体阴性（-）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。复检试验对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。样本初筛检测一阴一阳均阳性反应阴性报告送确认重复检测阴性报告均阴性反应阳性反应原有试剂＋另一种原理初筛试剂选用初筛试剂阴性反应HIV抗体筛查检测流程图(1)酶联免疫吸附试验（ELISA）可使用血液、唾液、尿液样品单纯HIV抗体检测试剂HIV抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。四代艾滋病酶联免疫试剂比较solidphasespecificdetectionofconjugate第一代病毒裂解液HIV-1IgG抗体HIV-1-IgG抗体第二代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2IgG抗体HIV-1/-2IgG抗体第三代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-OIgM/IgG抗体HIV-1/-2/-O病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-O第四代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24AbIgM/IgG抗体HIV-1/-2/-Op24抗原病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24抗体method间接间接夹心夹心固相抗原标本（含抗体）酶标二抗底物EEE间接法检测抗体E固相抗原标本（含抗体）酶标抗原底物EE双抗原夹心法检测抗体ELISA测定中的干扰因素内源性干扰因素外源性干扰因素内源性干扰因素类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子等外源性干扰因素溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融操作中的注意事项加样温育洗板显色标准化操作及流程试剂准备、标本收集、测定方法和仪器操作写出正确的“标准操作程序”(SOP)，所有的实验技术人员在进行相关测定时，必须严格按相应的SOP进行操作。ELISA法结果判断临界值概念:将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值判断标准:标本OD值与临界值的比值大于等于1(S/CO≥1)为阳性（对间接法及双抗原夹心法）注意:不同厂家、不同方法临界值计算公式不同cutoff=NC+0.1(0.15,0.12)cutoff=NC*2.1酶联免疫吸附试验（ELISA）优点：准确性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存用途：流行病学监测及临床大量标本的检测(2)化学发光或免疫荧光试验采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。（3）快速检测（RT）及其它检测试验优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在10～30分钟内得出结果。缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。（1）明胶颗粒凝集试验（PA）将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。快速诊断试剂PA法原理（2）斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上,加血清样品。斑点EIA法用酶标记抗体，以后步骤同ELISA。斑点免疫胶体金（或胶体硒）用红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白标记，用渗滤法作为洗涤方法。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10min以内，使用抗原量少。快速诊断试剂金标诊断试验原理快速诊断试验（3）免疫层析试验(金标法、硒标法)以硝酸纤维膜为载体。加样区：预包被胶体金-抗原/胶体金-proteinA结合物测试区（T）：固定有重组HIV抗原，质控区：抗HIV单克隆抗体/抗-proteinA抗体快速诊断试剂全血样品加50ul样品于样品垫中手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取结果硒标法操作步骤病人条质控条快速诊断试验优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在10～30分钟内得出结果。缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。注意：一定要将试剂平衡至室温快速诊断试剂HIV抗体确认试验确认试验的试剂：必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确认试验方法：免疫印迹试验(WB)条带免疫试验(LIATEKHIVⅢ)放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)国内常用的确认试验方法是WB。HIV抗体确认实验结果a强阳性对照（HIV-1和HIV-2）b弱阳性对照（HIV-1）c阴性对照d典型的HIV-2血清阳性反应abcdgp160gp120p66p55p51gp41p39p31P24p17血清对照HIV-2特异带WB确认HIV感染的判定标准和判定结果的基本原则HIV-1抗体阳性：gp41和Gp120/gp160或加上gp41加上P24阴性：无HIV抗体特异带出现。可疑：出现HIV抗体特异条带，但不足以判定阳性HIV抗体确认试验不确定结果P24：非特异性反应（孕妇，正常人）Gp160：非特异性反应，感染早期，感染晚期Gp160，gp120：非特异性反应，感染早期，感染晚期Gp160，p24：非特异性反应，感染早期，感染晚期HIV抗体确认试验不确定结果P24：非特异性反应（孕妇，正常人）Gp160：非特异性反应，感染早期，感染晚期Gp160，gp120：非特异性反应，感染早期，感染晚期Gp160，p24：非特异性反应，感染早期，感染晚期Gp160，gp120，p24：感染早期，感染晚期污染？筛查试验阳性反应样品HIV抗体确证检测流程图结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。确证试剂根据具体情况进一步检测HIV-2报告阴性出现HIV-2指示条带阴性反应不确定反应报告HIV-1阳性HIV-1阳性反应HIV抗体检测的要点1、根据目的选择检测方法及检测策略。2、严格遵守实验室SOP。3、筛查试验阳性，须作确证实验。4、筛查试验阴性，不应做确证实验。5、筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。HIV抗体检测不能用来诊断：HIV急性感染新生儿HIV感染艾滋病病毒感染产妇所生儿童阳性阴性用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测12个月进行HIV抗体筛查试验确证试验18个月时再进行HIV抗体筛查试验报告HIV抗体检测结果阴性艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程阳性阴性阴性阳性用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测阴性阴性阳性报告HIV抗体检测结果阳性提供咨询，继续随访，4周后再次进行确证试验不确定阳性婴幼儿HIV感染的抗体检测适用范围：HIV感染产妇所生婴幼儿；已满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。婴儿应于12个月进行HIV抗体检测，结果阴性则排除感染，纳入正常儿童保健；阳性者继续追踪随访，至18个月再次进行HIV抗体检测，结果阴性排除感染。谢谢！