层析分离法

层析分离法特点：（1）纯化倍数高（2）操作规模小，放大困难（3）终产品纯化（4）适用于价格昂贵的产品色谱法(chromatography)——以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法。色层分离法基本原理色层分离法基本原理分子筛层析示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：层析的发展史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938TaylorUray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson创立了毛细管电泳法。分类按溶质分子与固定相相互作用机理吸附层析：离子交换色谱疏水作用层析金属螯合色谱共价作用色谱分配层析凝胶过滤亲和层析类型机理优点缺点适用范围吸附色谱化学、物理吸附操作简便易受离子干扰各种生物大分子的分离、脱色、和去热源凝胶过滤分子筛的排阻效应分辨力高，不会引起变性各种凝胶介质昂贵，处理量有限制分子量有明显差别的可溶性生物大分子分配色谱溶质在固定相和流动相中分配系数的差异分辨力高，重复性较好，能分离微量物质影响因子多，上样量太小用于各种生物大分子的分析鉴定亲和色谱亲和色谱生物大分子与配体之间有特殊亲和力分辨力很高一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大各种生物大分子聚焦色谱等电点和离子交换作用分辨力高进口试制昂贵蛋白质和酶按实验技术分类低压（小于0.5Mpa)中压(0.5-5Mpa)高压(5-40Mpa)电泳(溶质在电场中移动）根据固定相形状分类柱层析、纸层析、薄层层析根据流动相分类气相层析、液相层析、超临界流体层析⑴分析色谱（10mg）⑵半制备色谱(10-50mg)⑶制备色谱(0.1-1g)⑷工业生产规模色谱(20g/d)按制备规格基本概念分配系数；解离常数；分离因素；阻滞因子；溶出体积；分辨率；溶量因子基本概念（1）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值（2）解离常数：有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与溶质在固相中的浓度比值（3）分离因素：某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数(4)阻滞因子：分配层析溶质移动速度（距离）与流动相移动速度（距离）比值(5)洗脱（容积）溶出体积：在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相体积(6)分辨率：两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比(7)溶量因子：固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比色谱体系中样品运行特点不同组分的差速迁移(differentialmigration):混合物各组分在两相分配系数不同，分配系数大的迁移速度慢，使同时进入色谱柱的各组分得以分离。同种组分的分子分布离散(sepreading)：入口处组分分布在一狭窄区带内，随着分子在柱内迁移，分布区带不断展宽，同组分分子迁移速度出现差异，主要是因为流体分子运动的速率差异造成，不是平衡分布不同引起。层析介质要求：（1）不溶于流动相（2）化学稳定（3）机械强度（4）大的表面积（5）粒度均匀种类：无机（氧化铝，硅胶，活性碳）有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺）氧化铝：多孔，微孔表面具有吸附性能比表面积大分子简单，空间形态复杂（8种以上）吸附量与含水量关系很大制备：氢氧化铝加热脱水吸附基团：铝离子种类：碱性；酸性；中性应用：有机溶剂中分离天然成分硅胶硅胶：多聚硅酸分子间脱水形成（1）化学组成SiO2.XH20（2）无定形结构（3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面分类特细孔硅胶(0.8nm以下)细孔硅胶（1.5—2.0nm)中孔硅胶(4.0一5.0nm)粗孔硅胶(10.nm以上)应用：优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物琼脂糖由海洋生物琼脂提取得到的主要成分①中性不带电②水溶性线状多糖③高亲水性，含大量羟基④能制成多孔性凝胶，分离大分子制备：（1）去除带电琼胶成分（2）将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化等方法制得珠状介质。（3）采用交联剂增加介质的机械强度商品种类Sepharose2B分离范围:70,000-40×106,Sepharose4B分离范围：60,000-20×106,Sepharose6B分离范围（球蛋白）：10000-4×106颗粒大小：40-165um:最高流速14cm/h。经过交联而增加机械强度的琼脂糖SepharoseCL-2B,SepharoseCL-4B,SepharoseCL-6B应用：水溶液中分离蛋白质葡聚糖α-1,6相连的G聚合物，环氧氯丙烷交联性质：（1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）（2）化学稳定性及热稳定性好（3）孔度与机械强度与交联度有关（4）用于凝胶过滤应用：水溶液中分离蛋白质等纤维素β-1,4相连的D-G线性天然高聚物（1）亲水（2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度应用：离子交换分离蛋白质介质聚丙烯酰胺性质：（1）丙烯酰胺与交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺共聚（2）控制交联剂比例可控制网格孔度（3）亲水性不如多糖介质（4）机械强度差应用：凝胶过滤，电泳层析装置与操作泵混合器层析柱检测器记录仪分部收集器装置柱层析分离法的有关装置紫外检测器分光光度计P-5磁力搅拌器部分收集器双笔记录仪酶活性紫外吸收蠕动泵层析柱混合泵酶试剂柱操作（1）装柱（2）平衡（3）上样（4）洗涤（5）洗脱（6）清洗（7）再生层析材料的准备:装柱前用溶剂平衡凝胶层析材料：溶胀吸附剂：加热或酸处理离子交换剂：：酸碱处理在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。装柱调糊：50%（缓冲液＋介质）一次连续加入悬胶液，避免分层打开出口阀：层析剂沉降排除空气：沿着玻棒倾注检查均匀度关闭出口→用溶剂灌注至1／3体积→加浆状物→放出过多溶剂如二次填装，应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。上样样品处理：(1）溶解A调整浓度：减少样品溶液体积，使区带狭窄B盐CpH(2)过滤：除去不溶物流速：根据样品浓度与吸附速度而定上样量：80%吸附容量淋洗（去除残留在介质中的杂质）盐浓度pH表面活性剂（0.1-0.5%)淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定防止产物丢失又要除去杂质洗脱方法按操作方式a恒定洗脱(isocraticelution)b分步洗脱(stageelution)c梯度洗脱(gradientelution)逐渐改变溶剂的性质，形成一个离子强度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱优点：减少拖尾现象按洗脱机理专一性洗脱（specificelution）非专一性洗脱（nonspecificelution）添加剂：乙二醇,NaCNS、脲素、盐酸胍洗脱体积：5倍床体积Elution(ml)Protein(mg/ml)NaCl(mol/L)00.20.40.60.800.20.40.60.8104080120160200240NaClProtein恒定洗脱Volume(ml)Protein(mg/ml)NaCl(mol/L)00.10.20.30.400.20.40.60.804080120160200240NaClProtein分步洗脱Volume(ml)Protein（mg/ml)NaCl(mol/L)00.10.20.30.40.50.600.10.20.30.40.50.60.704080120160200240ProteinNaCl梯度洗脱部分收集部分收集器：使每管按预定时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。每一部分的蛋白质或核酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280nm或260nm的光吸收来进行连续监测。清洗与再生弱酸：HAC碱：氨水促溶剂：1-3MKCNS，6-8M尿素，6M盐酸胍极性溶剂：20%乙醇表面活性剂缓冲液平衡亲和层析亲和层析：利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。(1)酶—底物或抑制剂(2)抗原—抗体。(3)激素—受体。(4)糖蛋白与凝集素,(5)生物素—生物素结合蛋白等基质活化方法与配基偶联活化:基质（matrix）上的化学基团是不活泼的,无法与配基直接偶联,通过化学反应使介质上化学基团处于活化状态。(1)大分子配基可与活化基质直接偶联。(2)小分子配基,在基质上接若干C原子手臂(spacer),然后再与配基偶联。(3)环氧氯丙烷,1,4－丁二醇缩水甘油醚本身是活化剂亦具有手臂作用。活化方法A溴化氰法碱性条件，与多糖上的-OH反应导入氰酯键或亚氨碳酸酯优点:（1）适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质（2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联（3）操作步骤简单,重现性好。（4）偶联条件温和缺点：（1）形成的异脲键易产生非特异性吸附（2）不稳定,配基易脱落（3）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放溴化氰活化与配基偶联化学反应式—OH—OHCNBr—OH—O—CN—O—OCNHR-NH2R-NH2—OH—O—CNH-RNH2+异脲衍生物—O—OCN-R取代亚胺碳酸盐环亚胺碳酸盐氰酸酯B环氧氯丙烷（1）形成的共价键稳定,配基不易落脱（2）自动引入手臂（3）有更小的非特异性吸附,（4）活化操作简单易行,危险性相对较小缺点：强碱性条件反应。环氧氯丙烷活化反应式环氧基的氨化及偶联配基反应C对甲苯磺酰氯活化（1）用于含羟基基质,将羟基转化为磺酰基,（2）形成稳定化学键。（3）在无水丙酮环境中进行。偶联配基在有机相或水相中进行对甲苯磺酰氯活化反应式手臂（spacer)作用：减少亲和作用空间位阻手臂化合物：乙二胺NH2-CH2-CH2-NH2已二胺NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH26-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH环氧氯丙烷1，4-丁二醇缩水甘油醚残余电荷的掩蔽目的：防止产生非特异性吸附原理：通过化学反应消除基团上的电荷方法：氨基：醋酸酐羧基：水溶性碳二亚胺NH2CCOOOCH3CH3+H2ONH-O-C-CH3OCH3OCOH+手臂氨末端的掩蔽残留羧基掩蔽反应活化基团与配基密度测定方法：（1）氨基或羧基可用酸碱滴定。（2）有紫外吸收特征的,可用紫外分光法测定。（3）通过测定反应余液中配基残留量推算（偶联率较高的情况）（4）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定疏水层析将疏水性基团如丁烷、辛烷、苯固定化到介质上,这些基团会与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和介质配基密度:40—80μmol/ml胶,吸附容量：牛血清蛋白(BSA)大于40mg/ml疏水层析介质制备过程示意图羰基二咪唑工艺条件吸附：(1)盐浓度：1—2M(NH4)2SO4或NaCl(2)pH:中性或偏酸性淋洗：0.5—2%表面活性剂洗脱:(1)0.1—0.5MNaCl(2)低浓度促溶剂,0.1—0.5%NaSCN,或20—40%乙二醇固定化金属离子亲和层析层析剂：琼脂糖→环氧活化的琼脂糖→双羧甲基氨基琼脂糖→稳定的吸附中心吸附机理：金属螯合介质能结合咪唑基及巯基Cu2+,Zn2+，Ni2+工艺条件