定点突变技术

定点突变技术•基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等•根据其特点可将基因突变技术分为两大类：位点特异性突变定点突变随机突变定点突变的研究意义1对调控区进行突变研究基因结构与功能之间的关系2对编码基因进行突变检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用。获得突变蛋白。位点特异性突变的类型•寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。•盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。•PCR介导的基因突变Kunkel法在E.coli中dUTPdUMP在dUTP酶缺失体中（dut-）dUTPdUMP在正常情况下，尿嘧啶－Ｎ－糖基化酶(ung-)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。因此在大肠杆菌dut-ung-菌株中生长的M13噬菌体的DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级原理Kunkel法小结•用此种方法产生的突变体不必利用核苷酸探针标记来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体，这样就免除了繁杂的杂交程序。•此法的成功关键，是要得到好的含Ｕ单链模板DNA。（可用含有目标基因的M13双链DNA载体感染E.coliCJ236品系，其为dut-ung-菌株）Oligo诱导突变的改进方法•武汉大学的叶林柏等人对Oligo诱导突变方法进行了改进。2-3个核苷酸替换的突变频率可达80%-85%，即使是需要有道连续4个氨基酸缺失，突变频率也高达40%－５０％。原Kunkel法改进后的方法DNA聚合酶和T4连接酶同步加入分级退火，冰浴稳固异源双链再加T4连接酶直接用反应混合物转染经酚-仿抽提后再进行转染转染效率：3个空斑转染效率：78个空斑PCR介导的基因突变•在基因5’和3’末端产生突变•重叠延伸PCR•大引物PCR法重叠延伸PCR法小结缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且需要对中间产物进行纯化。优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运用非常广泛同时利用重叠延伸PCR机设可以对基因中心区段进行取代、插入、缺失的突变各种方法的比较寡聚核苷酸介导的突变盒式突变PCR介导的突变优点保真度高简单易行突变效率高操作简单突变成功率高缺点操作复杂周期长合成多条引物成本高受到酶切位点的限制后续工作复杂TapDNA聚合酶保真性偏低应用•一步反向PCR法•Stratagen公司的Quickchange试剂盒一种简便快速的定点突变的方法•Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链DNA质粒为模板,只需一对引物，进行一次PCR,在1～2d内即可完成点突变过程。