食品微生物实验

食品微生物实验实验一培养基的配制、分装和灭菌目录1234实验目的实验原理实验器材实验方法657思考题注意事项实验结果实验目的了解配制微生物培养基的原理和培养基的种类；掌握配制培养基的一般方法和操作步骤；懂得高压蒸汽灭菌的基本原理及使用注意事项；了解几种常用灭菌方法。实验原理培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。根据据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。根据用途可分为:1.基础培养基：能满足各种微生物的营养需求2.加富培养基：加入某种微生物生长繁殖所需的营养物质，使其快速生长，便于分离3.选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目标微生物得到富集，便于分离4.鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性。从培养基的物理状态可分为:1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。实验原理灭菌:是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。消毒：使用理化因素方法杀死物体表面绝大多数微生物的方法。常用的灭菌法1、干热灭菌：用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌适合于培养皿，试管，吸管等的灭菌。160-170℃，保持2h。2、湿热灭菌加压蒸汽灭菌法其步骤如下：1）灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。2）接通电源，进行加热3）排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。4）当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为121℃，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。5）灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。紫外线灭菌法：一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。化学药剂消毒灭菌：微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。1.药品和试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10％NaOH溶液、10％盐酸溶液。2.器材天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、PH试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、棉花、线绳、干燥箱、高压锅。实验器材•培养基的配制•分离培养微生物常用器皿的准备•培养基和玻璃器材的灭菌实验步骤培养基的制备过程配方及配量---称取药品----加热溶解----调节pH----过滤----分装----加棉塞----包扎----灭菌----搁斜面----贮存实验方法1.称量按照培养基配方与配量分别称取各药品。取少量的水于烧杯中，将各培养基成分（琼脂除外）逐一加入水中待溶。2.溶解在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。3.调节pH值用玻璃棒沾少许液体，测量pH值。用1mol/L氢氧化钠和1mol/L盐酸调节pH。4.加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。实验方法5.分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。6.包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。7.灭菌：高压蒸汽灭菌，121℃，20min8.搁斜面：9.贮存:培养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。实验方法实验方法注：灭菌后的培养基冷却至50-60℃后搁置斜面。斜面的长度不超过试管总长的一半。实验方法实验方法1、牛肉膏蛋白胨固体培养基2、察氏培养基（培养霉菌用）3、马铃薯葡萄糖琼脂培养基4、高氏1号培养基（培养各种放线菌用）称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；蛋白胨极易吸湿，称取动作要迅速；配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，要求不断搅拌，以免糊底，并防止沸腾外溢；分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基约为管高的1/4，三角瓶不超过瓶体的1/2；分装时不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免引起污染。注意事项1.思考牛肉膏蛋白胨培养基属于何种培养基？2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？思考题实验二环境微生物的监测和菌落识别1.掌握各种微生物接种的基本操作技术；2.初步了解周围环境中微生物的分布状况；3.熟悉四大类微生物菌落的形态特征。实验目的在我们周围环境中存在着种类繁多、数量庞大的微生物，他们很小，人们用肉眼看不到，将他们在适宜的温度下培养一段时间，可繁殖成一个个肉眼可见的细胞群体，此即为菌落。接种是指在无菌操作条件下，将某种微生物的纯种移接到适合其生长繁殖的新鲜培养基中或生物体内的一种操作过程。实验室常用的接种方法有斜面接种、穿刺接种、三点接种和液体接种。实验原理实验器材1.菌种实验室环境微生物、大肠杆菌、酿酒酵母、放线菌及霉菌。2.培养基马铃薯固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏一号固体培养基3.器皿无菌培养皿、无菌棉签、火柴、超净工作台及恒温培养箱。实验方法1、融化培养基1）沸水浴融化法：取装有无菌营养琼脂培养基的三角瓶一个，放在沸水浴中煮沸维持，待琼脂彻底融化（从水浴中取出，在不摇动下对着透视光观察为均质无块状液态）后取出，室温下放置待冷却至50-60℃（以手握不觉得十分烫手）时倒平板。2）微波炉融化法：采用微波炉加热融化琼脂培养基，应根据加热功率大小及待融化培养基的量来决定所需时间。否则将导致水分蒸发过多、培养基剧烈沸腾使三角瓶口棉塞冲脱而溢出培养基或引起棉花塞燃烧等事故。3）压力锅融化法：当需融化的培养基量较多时，用压力锅融化较快速。方法是将待融化琼脂培养基放入锅内，采用100-105℃的锅压维持5-10min即可。4）冷却需注意：融化的琼脂培养基一般采用室温冷却，但在室温较低时切莫用冷水直冲瓶壁某处（会首先导致琼脂凝块现象）。若将融化的培养基直接放在冰凉而热传导很快的瓷砖或不锈钢桌面上，也可因瓶底过冷而产生凝结现象。实验方法倒无菌平板：1）持皿法倒无菌平板：培养基的倒入量为12-15ml。2）叠皿法倒无菌平板冷凝方法：一种是将平板一个个摊平在桌面上让其迅速冷凝，另一种方法是将几个平板叠放成一叠让其缓慢冷凝。前者冷凝较快，在室温较高时常采用。但缺点是有时在皿盖或凝结的培养基表面有冷凝水产生。而后者冷凝速度较慢，常在室温较低时应用，其优点是在缓慢冷凝中平板表面及盖内侧很少有冷凝水微滴形成。实验方法1.斜面接种2.液体接种由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接、触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。实验方法3.穿刺接种用接种针挑取菌种后，插入固体培养基内（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。4.平板接种将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：实验方法1)斜面接平板a.划线法：见平板划线分离法。b.点种法：常用于观察霉菌和酵母细胞，轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）。2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。实验方法平板划线实验方法挑孢子：将灭过菌的接种针在菌种管斜面上端冷却并湿润后，再用针尖挑少量孢子。当移出接种针前，须将针柄在管口轻轻碰几下，以抖落未粘牢的孢子。然后移出接种针，塞上棉塞，将菌种管插回试管。点接：左手将预先倒置在煤气灯旁的含培养基的皿底取出（皿底朝上，仍放在煤气灯旁），随之将培养基一面朝向火焰，并使皿底垂直于桌面，将沾有孢子的接种针尖垂直地点接于标记处，然后将皿底轻轻地放入皿盖中。最后将带菌的接种针烧红，以杀灭残留的孢子。三点接种实验方法实验方法环境微生物的检测1）空气做实验室空气中微生物的检测时，只要打开无菌平板的皿盖，让其在空气中暴露一段时间（5-10min），即让空气中含微生物的尘埃或微粒以沉降法自然接种到平板培养基的表面，然后将皿盖盖上即可。2）桌面在做实验桌面的微生物检测时，可用一枚无菌棉签，先在手持无菌平板的半侧润湿后划数条“Z”型的接种线，以此作为无菌棉签试验的无菌对照区域。然后仍用此棉签去擦抹桌面，再在平板的另半侧的表面作同样的划线接种。上述操作均应以无菌操作法进行，即在火焰旁的无菌操作区域内完成。3）头发移去无菌平板的皿盖，使自己的头发部位保持在平板培养基的上方，然后以手指拨动头发数次，再盖上皿盖，就可以粗略测知头发中所含带菌尘埃的多少及其含菌的种类等。4）手指可用未经清洗的手指先在无菌的平板培养基的左半侧作划线接种，并在皿底做好标记。然后用肥皂洗手，待手指冲洗干净后再在平板培养基的另半侧作同样的划线接种，然后盖好皿盖。待培养后比较平板两侧所形成的菌落或菌苔的差异来判断手指的含菌量。实验方法5）口腔打开无菌平板培养基的皿盖，使口对着平板培养基的表面，以咳嗽或刺激鼻腔打喷嚏方式接种；也可用长的无菌棉签从口腔或咽喉等处取菌样，然后在平板表面作划线分离，再盖上皿盖，经培养后观察平板上的菌落或菌苔。培养将以上各种检测平板倒置于28℃温箱中培养，至下周实验时观察并计数各平板上的菌落数。若有时间，可从24h起观察数次，以了解各种平板及不同类型菌落出现的顺序及菌落大小、外形和颜色等的变化。实验方法实验结果放线菌酵母细菌霉菌用于倒平板的培养基一定要彻底溶化，否则会在所倒的平板培养基表面出现未融化的琼脂块。而且，倒平板时的培养基温度不能过高（50-60℃为宜），否则会在皿盖内侧形成较多的冷凝水或在凝固的平板表面形成许多冷凝水微滴，不利于单菌落的形成。在无菌操作倒平板过程中，切忌用手抓、握三角瓶的瓶口处，以防灼热的瓶口端烫伤手指，同时，手指上的微生物也会污染瓶的口端，造成严重的操作污染等。注意事项思考题实验三微生物的纯种分离法1.了解平板划线法分离菌种的基本原理及操作；实验目的平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实验目的1.样品混合菌液2.培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基3.其它盛9ml无菌水的试管、盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿。实验器材实验方法1、融化培养基2、倒平板在皿底用记号笔分成4个不同面积的区域，使A＜B＜C＜D,且各区的夹角应为120°3、作分区标记4、划线操作1）挑取菌样：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。2）先划A区：3）划其