中山大学生命科学学院-2011级-生物技术学-期末复习概要

中山大学生命科学学院2011级生物技术学期末复习概要1第一章基因工程发展大事记：1.20世纪20-40年代：一些酶提纯结晶2.1902年EmilFisher：蛋白质结构是多肽3.40年代末：Sanger分析肽链N端氨基酸4.1944年O.T.Avery：肺炎球菌转化实验5.1949-1952年S.Furbery等X-射线衍射分析-DNA是螺旋结构6.1953年Watson和Crick：DNA双螺旋模型7.1956年A.Kornberg：DNA聚合酶8.1972年PaulBerg：第一个体外重组DNA9.1977年WGilbert和FSanger，快速DNA测序法建立10.1988年PCR问世11.1900年JWatson人类基因组计划第二章典型的基因结构：中山大学生命科学学院2011级生物技术学期末复习概要2对于真核生物，编码区还含有内含子，在转录后加工除去。基因表达调控概述在原核生物中，常涉及到操纵子参与基因的表达调控。同时，基因的表达具有阶段性。真核生物的基因表达不通过操纵子调控，使用增强子或者衰减子参与调控等。基因表达除了具有阶段性以外，还具有组织特异性。第三章基因工程的基本技术核酸的制取技术DNA提取：细胞破碎→核酸蛋白分开→RNA、DNA分开→DNA纯化细菌为例：10%SDS，20mg/mlproteinaseK→苯酚（phenol）/氯仿（chloroform）/异丙醇→RNase→70%乙醇3M醋酸钠pH5.2→（保存）Tris/EDTA（TE）buffer，-20℃基因组DNA的片段化机械切割法：超声波、高速搅拌限制性内切酶→部分酶切Sau3AI/BamHIDNA片段的部分分离离心蔗糖密度梯度离心：氯化铯密度梯度离心：氯化铯在离心场中自行调节形成浓度梯度，并保持稳定。当管底介质的密度大于粒子的密度时，粒子上浮；在弯顶处则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身密度一致的区域。样品粒子的位置仅同样品粒子的密度有关。离心管顶部的密度为1.65，底部为1.75，DNA为1.70（密度单位）故DNA在中部，RNA密度＞1.8在底部。凝胶电泳：（核酸）核酸为多聚阴离子，电泳时向正极移动，相同数量双链DNA具有等量的净电荷，故泳动距离仅仅与分子量和核酸的构型相关。琼脂糖凝胶电泳：惰性介质、高聚合强度、低电内渗分辨率：0.2-50kb浓度：0.8%-1.0%常用缓冲液：TBE/TAE最低检测量：1-2ng应用：核酸分离，质粒构型、核酸纯度、浓度、相对分子量测定聚丙烯酰胺凝胶电泳：20%浓度可鉴定1bp中山大学生命科学学院2011级生物技术学期末复习概要3分辨率：1-1000bp染色方法→EB、SiberGreenGold核酸和蛋白质的检测——分子杂交→目标基因或蛋白的鉴定基本过程：核酸或蛋白的分离→转移到固相介质→标记探针与待测物结合→结合位置显示原理利用碱基后不配对原则或抗原抗体结合来探测样品，再利用探针上的标记显示出样品中目标物质。核酸探针的长度一般为20-500bp材料类型Southernblotting→DNA→定位目标DNA，如在基因组中的位置Northernblotting→RMA→分析RNA种类、大小、丰度，只能测定稳定存在的RNA。通常RNA转移到尼龙或者醋酸纤维膜。Westernblotting→蛋白→检测表达文库表达的蛋白质、分析蛋白质的表达情况。通常转移到硝酸纤维膜上，免疫染色放射自显影。转化子的筛选与重组子的克隆基于遗传标记的筛选与鉴定抗药性筛选→载体DNA上携带有受体细胞敏感的抗生素的抗性基因(如pBR322上四环素/氨苄青霉素)——插入失活筛选营养缺陷性筛选→载体分子上携带有某些营养成分的生物合成基因显色模型筛选法→LacZ’，β-半乳糖苷酶基因以及146个氨基酸残基的编码，表达无活性不完整酶，α受体；宿主基因组中有另一部分，α供体，两者结合后将无色的，5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷（X-gal），水解蓝色。诱导剂β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。噬菌斑筛选→转化子在固体培养基中理解形成噬菌斑，非转化子正常生长基于克隆片段的筛选与鉴定PCR鉴定法菌落原位杂交→使用目的基因某一区域同源的探针，硝酸纤维素薄膜（对单链DNA或RNA吸附作用强于双链或蛋白）；可结合噬菌斑筛选。探针制备目的基因同源序列→同源性＞80%cDNA人工合成→通过氨基酸序列，可能需要制备多种，密码子简并性探针标记5’端标记：[γ-32P]ATP、过量ADP、T4-PNP酶。酶将标记的γ-磷酸基团转移到5’端反转录标记：mRNA、[γ-32P]ATP、ploy（T）引物反转录酶缺刻平移标记：DNaseI→DNA聚合酶I（5→3外切和聚合活性）→[γ-32P]ATP→变性ABC标记：生物素（biotin）共价交联dUTP，再通反转录或缺刻平移标记，生物素结合蛋白（avidin）限制性酶切图谱法亚克隆法DNA测序法中山大学生命科学学院2011级生物技术学期末复习概要4DNA的双脱氧末端终止测序法DNA大片段的测序战略分段克隆引物走读测序DNA全自动序列分析系统水平超薄凝胶电泳技术多路测序战略焦磷酸释放测序（454）基于外源基因表达产物的筛选与鉴定蛋白质生物功能检测法→根据表达产物的生物活性放射免疫原检测法→类似于菌落原位杂交，使用抗体蛋白凝胶电泳检测法→以非重组子作为对照，通过对比电泳图谱判断DNA测序Sangersequencing：利用ddNTP加入后，碱基互补配对延伸过程中掺入ddNTP不能延伸而终止，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率能够分辨到1bp的差异从而测出。目前常用的快速测序技术原理DNA全自动测序：水平超薄凝胶电泳：多路测序：454测序：PCR技术材料：模板、引物（17-20bp）、DNA聚合酶（Taq、Pfu）、缓冲体系（Mg2+、K+、pH8.5、Tris.CL、BSA、DTT、ddH2O）、dNTPPCR循环：加热解链→冷却退火→延伸影响PCR的因素模板纯度引物：长度、CG百分比、3’端碱基DNA聚合酶质量反应条件控制Reversetranscription(RT)-PCR基本步骤：RNA提取→纯化→电泳检测→定量→逆转录→RCR→检测应用：cDNA克隆、低丰度mRNA测定（基因工程原理p111）引物Randomprimer：随机的六聚体核苷酸Oligo(dT)primer：poly（A）的尾巴Sequence-specificprimerReal-timePCR原理与应用基本原理：每一轮PCR进行或者完成就有相应强度的荧光放出，这使得荧光强度和PCR进行次数成正比，通过与标准曲线中的荧光强度比较可以得出样本中模板上的目标DNA的拷贝数。不同的具体荧光标记的方法不同，比如Taq-man探针法、SYBR-Green-I染料法、分子信标（molecular-beacon）以及LUX-Primers等常见类别及原理中山大学生命科学学院2011级生物技术学期末复习概要5Taqman探针法Taq-man探针在完整时5‘端FAM发射光谱被3’端荧光基团TAMRA猝灭，不能接收到荧光信号。在PCR进行过程中，DNA双链解开，Taqman探针特异性结合目标DNA片段。延伸过程中，Taq-DNA聚合酶的5‘核酸外切酶活性将Taq-man探针切碎，从而导致FAM发射光谱不能够高效的传递给TAMRA，即荧光不能够被猝灭，用接收器可以接收到荧光信号。每复制一轮就会释放出相应强度的荧光。[Real-time-Q-PCR]。荧光强度同目标基因的拷贝一样，以指数的方式增长，取对数可以得到荧光强度和初始扩增目标基因片段的拷贝数线性关系，复制次数以CT值表示监测基因的表达强度细菌的转化转化扩增质粒、获得高拷贝以分析、获得单纯重组质粒、获得表达产物转化中的方法CaCl2可能能够使细菌的细胞壁的通透性增强，从而提高了转化率大肠杆菌CaCl2转化：加入质粒冰浴30min→42℃热激30-60s→冰上5min→LB培养基37℃培养1h→涂板5×106-2×107转化子/ug质粒电击转化利用瞬间高压（数千伏）处理细胞，微生物细胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中的核酸能够通过该孔洞进入细胞。不需要制备感受态，效率最高109-1010转化子/ug闭环DNA70%细胞因电击死亡高效转化，如基因文库构建；对象为细菌、酵母Notes1.E.coli4,000kb；A.thaliana70,000kb；H.sapiens2800,000kb；Mouse3300,000kb2.探针的合成a)据已知序列b)据氨基酸序列合成简并引物3.缺刻平移法4.探针的常用标记：32P，35S，Biotin，Digoxigenin5.探针标记方法a)3’末端标记（书上也有标记5’端，见《基因工程》P61）b)缺刻平移c)随机标记6.DNA聚合酶的功能：polyI7.PCR过程中，如果目标蛋白的N端并不?？8.概念a)转化：一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生遗传性状改变的现象。在基因克隆技术中，尤指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因病在选择培养基上长出转化子的过程。b)转导：噬菌体→受体菌=转染c)接合：供体菌→受体菌d)生长相：e)感受态：细菌处于某些生长时期（常为对数生长期早、中），吸收外源DNA中山大学生命科学学院2011级生物技术学期末复习概要6能力最高，处于这种状态的细胞被称为感受态细胞。B.subtilis等在生长周期的每一阶段都会产生感受态细胞，E.coli（如DH5α）只会在生长周期的某一阶段（早中期）产生感受态细胞。f)转化子：感受态细胞+重组质粒→细菌直接吸收外源DNA并整合到自己基因组中而发生遗传形状改变的现象。?g)菌落形成单位：指在琼脂糖平板上经过一定温度和时间的培养形成的每个菌落（来源于单个或者多个细菌形成的集），是计算细菌或霉菌数目的单位。这个比“菌落数”更具有意义。（百度）h)转化效率（cfu/ug）:每微克DNA所转化形成的菌落形成单位数量。i)正选择：j)负选择：9.文献：EfficienttransformationofLegionellapneumophilabyhigh-voltageelectroporationa)存活率随电压升高而降低b)转化子效率随电压升高而升高c)转化子数量随电压时间延长和降低d)每毫升菌落形成单位随转化子数量增加而增加e)转化子随DNA量增加而增加转化效率降低第四章基因工程的工具酶宿主细胞的限制和修饰作用原理：宿主细胞的甲基化酶对自身DNA和相应噬菌体A的DNA进行甲基化保护，封闭了限制性内切酶的切割位点，从而噬菌体A能够在宿主中复制。而对于外来的其他噬菌体，因为其DNA上由限制性酶切位点，而被宿主的限制性内切酶降解。有些免于降解的DNA得到复制，最后可能被宿主的甲基化酶修饰，从而稳定的感染。常见生物的基因组大小大肠杆菌E.coli4.46Mb＞1000genes枯草柑橘B.sublitis4.21Mb酿酒酵母S.cerevisiae12.5Mb~6000genes果蝇D.melanogaster150Mb小鼠Musmusculus3300Mb＞30000genes人H.sapiens3000Mb＞30000genes限制性内切酶来源：原核细胞，细菌、蓝藻、链霉菌、支原体（极少）等分类：I型：非特异性切割II型：特异性切割，切割位点与识别位点相同III型：特异性切割，切割位点与识别微点不同II型特点单一肽链组成单体、同型二聚体（多数）、四聚体特异性识别切割双链DNA分子：①识别序列4-8bp，或更长②回文结中山大学生命科学学院2011级生物技术学期末复习概要7构③同DNA来源无关（被甲基化等修饰后可能不能被切割）④粘末端（5’凸-B