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酶联免疫吸附测定实验报告ELISA一实验原理酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括：抗原(抗体)吸附在固相载体上——包被，加待测抗体(抗原)，加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物，在于该酶的底物反应生成有色产物。然后借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。ELISA常用的有4种方法，分别是直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法。在我们的实验中，采用的是间接法。主要步骤有：将抗原吸附于固相载体表面；加抗体，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物(测定底物的降解量=抗体量)。二实验用品及器具1聚苯乙烯微量细胞培养板(平板，96孔)2酶联免疫检测仪3辣根过氧化物酶羊抗兔IgG4包被液0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)Na2CO30.15gNaHCO30.293g蒸馏水稀释至100mL5稀释液(PBS-Tween)NaCl8gKCl0.2gKH2PO40.2gNa2HPO4·10H2O2.9g6Tween-20,0.5mL蒸馏水加至1000mL7洗涤液：同稀释液8封闭液：质量分数为0.5%的BSA(用PBS配制)9邻苯二胺溶液(底物)配置：0.1mol/L柠檬酸(2.1g/100ml)，取6.1ml0.2mol/LNa2HPO4·12H2O(7.163g/100ml)，取6.4ml加蒸馏水12.5ml取邻苯二胺8mg(溶解)临用前加30%(体积分数)H2O240μL10终止液：2mol/LH2SO4三实验步骤1在培养板的B2-B10、C2-C10、D2-D10号的well中分别加入0.025mg/ml的含HumanIgG的包被液各200μL，在37℃的环境中存放30min2取出培养板，将包被液倒出，用PBS-T洗涤三次，每次每格200μL3洗涤之后加入含0.5%BSA的PBS(封闭液)，每格200μL，在37℃的环境中存放30mim4取出培养板，将封闭液倒出，用PBS-T洗涤三次，每次每格200μL5将浓度为1:400的Rabbit-α-humanIgGantiserum溶液(一抗)稀释为浓度为1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200的溶液，一次加入B2-B9、C2-C9、D2-D9，每格200μL，在B11、C11、D11中加入1:400的溶液200μL，在37℃的环境中存放1h6取出培养板，将溶液倒出，用PBS-T洗涤三次，每次每格200μL7在B2-B11、C2-C11、D2-D11中分别加入Goat-α-rabbitIgG-HRP(浓度为1:20000)溶液(二抗)，每格200μL，在37℃的环境中存放30min8取出培养板，将溶液倒出，用PBS-T洗涤三次，每次每格200μL9每格加入200μL邻苯二胺溶液进行反应，约5min后加入终止液(2mol/L的H2SO4溶液)10将培养板放入酶联免疫检测仪内进行分析，得出数据四实验数据内含溶液说明Well1Well2Well3Average(thegreennumbersarenotused)21:4000.6080.5910.4460.599531:8000.3690.5740.4760.52541:16000.4980.50.450.48266751:32000.4580.3980.3740.4161:64000.3630.3320.4030.36671:128000.2760.2740.290.2881:256000.2060.1820.2190.20233391:512000.140.1250.1410.13533310NofirstAntibody0.0190.0150.0190.01766711NoAntigen0.1820.1750.1820.179667数据图表如下:(从图表中可以看出，在1:400到1:51200浓度的范围内，数据基本上是呈线性变化的)由图线可知，在误差范围内，吸光度与被检血清浓度接近正比关系。这与公式：“吸光度=e×光径×浓度”是吻合的。五实验后感想这是我进入大学以来真正意义上的第一个实验，虽然整个实验的过程可以说有些枯燥乏味，因为大部分的时间都在等待中度过，但是不得不说，在这次实验中还是收获了不少的东西。首先，这次实验所涉及的内容是我以前完全没有接触过的。在中学里学到的知识也许只能勉强解释一下抗原抗体是什么，是怎么工作的，但是在定量检测的这一块却从来没有接触过。所以这一次的实验也算是给自己开了开眼界，增长了知识。也许在以后的学习中，可能也会用到相关的知识，毕竟我是学生物医学工程的，以后难免会遇到一些有关的问题，这也00.10.20.30.40.50.60.7算是一次提前学习吧。其次，相对于其他实验来讲，像这种类型的实验，对于每种试剂的量的要求是相当高的，也就是说，可能只是手轻轻一抖，整个实验就必须得重新来过，所以这也是一个对自己的耐心、细心程度的锻炼。做实验，团队合作是必不可少的，一个人做一个实验，总会出现这样那样的问题，导致实验失败，而两人的团队合作，就会使错误发生的概率降到很低，从而大大增加了实验的效率。最后还要感谢辛苦的老师和助教们。在这次实验中，让我见识了一位最可爱的生物老师——余老师，在她不到一个小时的讲解时间里，都不知道被我们的笑声打断多少次了，幽默风趣乐观大概是我能想到的描述余老师最准确的词了。还有几位不辞辛劳一直在我们四周帮助我们的助教们，谢谢你们，让我有了一次如此精彩的经历。