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大规模细胞培养和微生物发酵技术细胞培养的概述•动物细胞的特点：无细胞壁倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成原代细胞培养50代即开始退化动物细胞培养的概述•动物细胞培养的定义：动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术动物细胞培养的概述•生长特性贴壁生长型：如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴细胞等体外培养细胞的基本技术•体外培养特点•体外培养工具•体外培养条件•体外细胞生长增殖过程•培养方法•大规模培养技术体外培养的特点•营养条件苛刻•适应性差，敏感•培养时间长，易污染体外培养的条件•温度，37℃•pH：7.2-7.4•气体：氧，二氧化碳，氮气•营养条件：需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可由血清提供细胞大规模培养技术细胞大规模培养的方法•反应器贴壁培养容易换液，不需特殊的分离细胞和培养液的设备，可采用灌流培养获得高密度，但扩大规模较难，适合制备量小，价值高的生物药品。（CelliGenPlusTM）•微载体培养最有前途的动物细胞大规模培养技术，兼有悬浮培养和贴壁培养的优点，易于放大。（Cytodex，Cytopore和Cytoline）•无血清悬浮培养用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养技术动物细胞大规模培养过程中重要参数•pH•溶氧•温度•谷氨酸/谷氨酰胺•葡萄糖•乳酸•CO2动物细胞大规模培养过程中重要参数•NH4+•K+/Na+•Ca++•渗透压•细胞密度动物细胞大规模培养存在的问题•细胞凋亡•细胞在高密度条件下，由于细胞的多层生长，存在细胞接触抑制效应，细胞的生长和表达均受到严重影响动物细胞大规模培养存在的问题•细胞凋亡主要是细胞生长的条件较恶劣，包括：1.营养缺乏2.有害代谢产物的积累3.pH和溶氧控制不当4.机械搅拌剪切力较大5.渗透压细胞大规模培养的应用•生产疫苗•蛋白质和多肽药物•基因治疗•单抗微生物培养技术概述传统：酿酒、抗生素、制醋基因工程：生产蛋白质药物、疫苗等（大肠杆菌、酵母）一般采用高密度发酵技术微生物培养培养过程决定于：菌种培养条件微生物培养过程重要参数：温度pH溶氧葡萄糖/甘油乙酸•乳酸•NH4+•磷酸盐•乙醇(酵母)•甲醇(酵母)•细胞密度微生物高密度培养发酵培养基表达基因的调控宿主菌质粒的拷贝数及稳定性高密度培养的关键是发酵的补料控制,根据重组菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养物质的流加方式恒速流加变速流加指数流加微生物高密度培养乙酸的形成:培养液中葡萄糖的含量超过菌体生长所需量或在缺氧的情况下,便会大量产生乙酸.减少乙酸的策略:限制性流加葡萄糖甘油代替葡萄糖降低培养温度•宿主菌•降低比生长速率•透析培养细胞培养和微生物发酵中的重要参数了解生物技术的应用pH•不同的细胞具有不同最佳pH范围•pH能影响葡萄糖和谷氨酰胺的代谢，在低pH条件下，葡萄糖消耗速度慢•pH能影响细胞的生长和目标产物的量EffectsofpHonIgGProduction0102030406.877.27.47.6pHUnitslogH+CO2•在细胞培养过程中，CO2与碳酸氢盐形成缓冲对，稳定培养液中的pH•CO2也可用于计算呼吸商，反应细胞活力和代谢旺盛程度•细胞代谢（呼吸作用）会产生CO2(废物)–CO2水平增加会抑制细胞生长和细胞活性，从而影响目标蛋白的表达，当溶液中CO2达到14-15%时，会严重抑制细胞的生长CO2+H2OH2CO3H++HCO3-DO(溶氧）葡萄糖等需氧来氧化产生ATP供细胞的能量•用于测量和跟踪细胞消耗氧的速率.OxygenConsumptionRateofCellsinCulture00.10.20.31015202530354045Time(min)O2:mmol/L溶氧•在细胞培养和发酵过程中，O2通常是限制营养成分，是因为它在溶液中低溶解度:–通常关心对培养液中%O2,也就是“溶氧”值(DO):–理论DO:80%+/-5%(哺乳动物细胞培养)90%DO2(细菌培养）–O2也可能通过自由基形成对细胞造成伤害,在低pO2水平，细胞的活性通常越高(O2值必须维持在最低的水平)–然而,原代细胞可能在低O2条件下繁殖受延迟因而，维持正确的O2的平衡，对保证所有细胞正确生长都非常重要,一般30-50%葡萄糖•葡萄糖两个主要的功能:–细胞的主要的能量物质–主要的细胞碳源•葡萄糖和谷氨酰胺是相互补充的:–产生其他代谢物(例如:天冬氨酸)–提供能量–在所有细胞中通过糖酵解途径转变成丙酮.•葡萄糖的代谢随细胞生长而增加.–葡萄糖通常是细胞生长的限制因素Gluc&CellDensityvsTimeinBatchCulture012345601530456075808590Time(min)Gluc(mmol)00.511.52CellCount(cells/ml)葡萄糖•监控细胞反应器和发酵罐中的葡萄糖水平:–保证细胞正常生长所需能量.•开发延长细胞培养周期的标准补料策略.•计算葡萄糖消耗速率和决定批次培养最佳的起始浓度.乳酸=氧化问题•在培养过程中，大多数乳酸来自于葡萄糖代谢，但也有一部分来自于谷氨酰胺代谢.–基于高细胞密度和深液位，氧的消耗非常大.–典型的范围(组织培养):0-5g/L•O2消耗导致乳酸的形成，最终导致pH的下降.–对恒定的pH:抑制细胞生长的乳酸水平在低到4mM到高达70mM(取决于细胞).•在大多数情况下，铵对细胞生长的抑制比乳酸更严重.Gluc&LactinBatchCulture05101520250123456Time(days)Gluc/LactmMLactGluc乳酸•监控长时间细胞培养中乳酸的积累.•计算乳酸产量与葡萄糖的消耗之间的代谢关系•考察乳酸盐对细胞表达产物的毒害影响铵•细胞培养和发酵中铵的来源:–主要来源:代谢谷氨酰胺(谷氨酰胺降解)谷氨酰胺降解成铵和吡咯烷酮酸–其他氨基酸的脱氨基作用•铵的水平也取决于细胞密度和细胞代谢方式.•引起细胞抑制的铵离子浓度范围:–从:0.5mM(LMouseCells)–到:40.0mM(M.AscitesTumorCells)(不同的细胞株对铵有不同的耐受度)CellCountsvsAmmoniaLevelsOverTime0501001502002503003504004505001234567Time(min)CellDensity(cells/ml)012345678Ammonia(mM)C.D.NH3铵pH会受NH3增加的影响:NH4+NH3+H+•铵的增加也会改变细胞内蛋白质的运动.监控发酵罐和生物反应器中铵的水平（废物）.•推算谷胺酰胺的降解水平.•考察铵浓度对细胞密度和产物浓度的影响.•监控引入培养基的质量.限制铵抑制的策略•增加换液的速率(补料).•维持培养液中低的谷氨酰铵浓度减少其转化和降解.•在低的pH培养减少NH3形成.•去除培养液中的铵:–酶转化–通过特殊的“PTFE”膜将NH3扩散到低pH溶液中•使用能够逐步接受高NH3浓度的细胞谷氨酰胺•与葡萄糖一样,谷氨酰胺也是细胞的主要物质:*碳和氮*能量•谷氨酰胺通常被认为是细胞培养的主要限制营养–谷氨酰胺是生物合成的前体物质:*嘌呤*嘌呤核苷–谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受体谷氨酰胺•监控谷氨酰胺的水平:–确保细胞生长所需的能量.•开发长时间细胞培养标准化补料策略.•计算谷氨酰胺的消耗速率和决定批次培养最佳的其始浓度.谷氨酸•需用来计算谷氨酰胺–需确证谷氨酸的浓度，确保没加进谷氨酰胺结果.•谷氨酰胺的降解产物Na/KNa-K:–对合适培养基生产很重要.–维持溶液/培养基合适的离子强度.渗透压•渗透压是溶液浓度的一个反应:–测定渗透压的参考方法是使用渗透压计–典型细胞培养液渗透压值:300+/-30mOsmol/kg.•渗透压升高50-100mOsmol/kg会明显影响某些细胞的生长.•某些溶液/化合物可作为渗透压的保护剂(维持渗透压稳定和更低).这些物质:–甘氨酸，肌氨酸，脯氨酸渗透压•用于对引进的培养基进行质量控制•关联渗透压与细胞数、细胞活性和产量的关系•监控连续补加营养引起渗透压的增加细胞密度•细胞密度通常等于“生物量”–它是指给定体积的细胞数，可以是体积浓度或百分比浓度.–它不是指活细胞数量(但可很好显示细胞活力）•细胞活力/活性测定取决于细胞的种类、细胞生命周期及膜的结构.•“活性取决于你怎样定义细胞.”细胞密度•细胞密度不意味着终产物量或生产率–它显示‘细胞体积/数量’,但不能体现:•是否细胞是正确细胞.•是否终产物是由细胞产生.•是否所有的细胞是活的.•在细胞中的终产物的量.