基因工程实验报告

基因工程实验报告、小麦GAPDH截短体的重组与表达摘要：本实验通过基因工程（geneticengineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。关键字：小麦基因；载体；感受态前言基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。（一）实验过程1.实验部分流程：片段胶的回收小麦幼苗小麦总RNA的提取RT-PCR扩增小麦GAPDH基因pGEX-4T-1质粒提取表达载体的构建表达菌株转化目的蛋白诱导表达目的蛋白Western杂交检测2．小麦总RNA提取（Trizol法）2.1材料小麦幼苗2.2试剂配制及器具处理①0.1％的DEPCH2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPCH2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。③无RNA酶灭菌水（DEPCH2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。④Trizol⑤75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。⑥氯仿(最好用新的)。⑦异丙醇(最好用新的)。2.3操作步骤：①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。②室温放置5min，然后加入200µL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。③12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。⑤重复步骤④。⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30µLDEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。3.RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1试剂①RNA模板②Olig（dT）18③反转录缓冲液④dNTP⑤M-MULV反转录酶⑥RNA抑制剂（RNasin）⑦PremixEXTaqDNA聚合酶⑧PCR特异引物3.2操作步骤：3.2.1RNA的反转录采用ThermoScientific（Fermentas）RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitTotalRNA6µL（需加入RNA约1μg）OligodTprimer1µLH2O（nuclease-free）5µL12µL65℃5min，补加下列试剂：5×Reactionbuffer4µLRibolockRNaseInhibitor1µL10mMdNTPMix2µLRevertAidM-MuLVReverseTranscriptase1µL20µL42℃60min70℃，5min，﹣20℃保存3.2.2PCR扩增目的基因用表达引物扩增目的基因（25µL体系）2×PCRMix12.5µL95℃1min95℃10s58℃20s72℃45s72℃10min16℃∞cDNA1µL引物GA22PDH1-11µL引物GAPDH1-21µLH2O9.5µLtotal25µLPCR产物经胶回收。4．核酸琼脂糖电泳分析4.1试剂①TAE缓冲液（50×）：用时需稀释50倍②点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：含0.25%溴酚蓝和40%甘油③溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶，注意EB具致癌作用。④琼脂糖4.2操作步骤4.2.1琼脂糖凝胶的制备称1g琼脂糖加入100mlTAE缓冲液中加热熔化。4.2.2胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TAE缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2mm。4.2.3点样每个样品中加入1/10体积Loadingbuffer（10×），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。4.2.4电泳接通电源，80V电压电泳40min左右，当溴酚蓝到达凝胶前沿约2㎝处时停止电泳。4.2.5观察及照相将凝胶取出，在EB溶液中浸泡10min后，用凝胶成像系统照相。5.pGEX4T-1质粒的提取5.1实验材料含质粒的大肠杆菌5.2试剂质粒提取试剂盒(天根生物科技)35cycles5.3操作步骤5.3.1培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24h，然后从平板上挑取单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃培养12h。5.3.2提取步骤①柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500µL的平衡液BL，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）②取1-5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。③向留有菌体沉淀的离心管中加入250µL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。④向离心管中加入250µL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。⑤向离心管中加入350µL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm（~13,400×g）离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将⑦吸附柱CP3放入收集管中。⑧向吸附柱CP3中加入600µL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。⑨重复操作步骤7。⑩将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。⑪将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100µL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm（~13,400×g）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。5.3.3琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA6表达载体和目的片段的酶切6.1试剂①BamHⅠ②SalⅠ③BamHⅠbuffer④质粒提取试剂盒6.2操作步骤6.2.1在LB液体培养基中接入带pGEX4T-1质粒的菌种，在37℃下200rpm摇菌过夜。参见实验8的方法提取质粒。6.2.2质粒DNA和目的片段的酶切管号①②pGEX4T-132µLPCR产物32µLddH2O10µL10µLBamHⅠBuffer（10×）5µL5µLBamHⅠ1µL1µLSalⅠ2µL2µL7载体和外源DNA的连接反应7.1试剂①目标DNA片段（PCR扩增产物）②载体（pGEX4T-1酶切回收产物）③10×ligation缓冲液④T4DNA连接酶⑤ddH2O7.2操作步骤取一个200µL的EP管依次加入下列试剂：2×buffer：5µLpGEX4T-1酶切回收产物：1µLPfu扩增并酶切回收的片段：3µLT4连接酶：1µL离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接3～4h。8感受态细胞的制备及转化8.1实验材料大肠杆菌Top10或BL21（DE3）PlysS8.2试剂①LB培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录2）②氨苄青霉素8.3操作步骤8.3.1感受态的制备①从LB平板上挑取单克隆于5mlLB培养基中，37℃200rpm摇菌12～16h。②将活化过的菌按1～5％的体积比接种到新的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌约2h，OD600约为0.4。③取1.5ml摇好的菌液于一个1.5ml的EP管中，4℃4000rpm离心3min，弃上清。④加250µL0.1M的CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4℃6000rpm离心1min弃上清。⑤加200µL0.1M的CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。置于4℃存放。12h内使用效果最佳。注意：无菌操作和保持低温。培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。8.3.2转化①将盛有感受态细胞的EP管放置于冰上10min，加入10µL连接产物（若加质粒，则只需加1µL），温和混匀，冰浴20~30min。②42℃热激90S。冰浴5~10min。③加入800µLLB液体培养基，37℃培养45～60min。4000rpm离心2min，弃去800µL上清液，剩余混匀用来涂板。④取含有50～100g/mlAmp的LB平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上先涂布4µL200mg/ml的IPTG和40µL20mm/ml的X-Gal），涂板。⑤37℃倒置培养16~20h。9克隆的筛选和快速鉴定9.1试剂①TaqDNA聚合酶②10×buffer（含MgCl2）③dNTP④Loadingbuffer9.2操作步骤9.2.1提取质粒测定取一培养皿在底部标记，待转化的细菌菌落长直径到2mm时，用接种针（或用灭菌的牙签、小枪头）挑取单克隆菌落，划在培养皿上作好标记的方格内；同时在对应编号的培养管中接种，培养管中含5mlLB液体培养基。培养皿37℃培养6h后4℃保存。培养管37℃振荡培养12h左右。用培养管中的菌液提取质粒。酶切电泳检查质粒或进行质粒PCR鉴定。9.2.2菌落PCR鉴定法直接用接种针或牙签挑取少许菌体加入20的PCR反应体系中。试剂体积（20µL）2×PCRMix10µL引物GAPDH1-11µL引物GAPDH1-21µL模板(单菌落)1个ddH2O8µLPCR程序：94℃3min94℃30s58℃30s30cycles72℃45s72℃10min电泳检测PCR产物，挑选对应的阳性克隆菌落。10目的基因诱导表达①分别挑取对照菌和重组菌菌落，接入5ml含Amp（100g/ml）的LB培养液，37℃振荡培养过夜。②分别取500µL过夜培养物接入5ml含Amp（100g/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h左右，至对数中期（OD600=0.5~0.6）。③向诱导管中加入IPTG使其浓度达到0.6mmol/L，25℃振荡培养过夜，收菌取样进行蛋白电泳检测。11WesternBlotting11.2试剂11.2.1细菌培养和诱导表达①LB液体培养基②IPTG③Amp11.2.2电泳试剂①30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29.0g，甲叉双丙烯酰胺1.0g，加水至100ml，棕色瓶4℃保存。②1.5mol/LTris-HCl分离胶缓冲液p