基因工程实验报告

1基因工程实验报告指导老师：***学号：2007083*****姓名：***班级：07生物技术班海南师范大学生命科学学院07级2010-10-25实验一植物总DNA的提取、纯化实验目的：掌握从植物的组织（细胞）中提取DNA的方法实验原理：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物。在高盐浓度条件下，核酸以稳定形式与去污剂CTAB络合于溶液中，当降低溶液浓度到一定程度时，CTAB与核酸2的复合物从溶液中沉淀下来，通过离心就可将该复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB溶于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB溶于乙醇中。仪器、材料与试剂主要仪器：水浴锅、离心机、研钵、涡旋仪主要试剂和材料：CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）裂解液：2%CTAB（W/V）、20mmolEDTA(pH8.0)、100mmolTris-HCl(pH8.0)、1.4molNaCl氯仿：异戊醇（24：1）。异丙醇，无水乙醇。TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1mmol/LEDTA实验步骤1.取2g左右的嫩叶子放入预冷的研磨中，第一次加入较多的液氮，开始先慢慢磨开后研磨中待液氮量较少时快速磨动，如发现液氮挥发完迅速加入液氮（加入时动作要轻，防止粉末溅起），重复两次。2.将粉末加入预冷1.5mlEP管中（约1/3）后，加入事先700ul65℃水浴的2%CTAB和30ul室温β-巯基乙醇（剧毒），轻轻摇动混匀。放入65℃水中水浴40min，每10min取出震荡使沉淀散开。3.取出后冷却至室温，加入氯仿/异戊醇（24：1，V/V）至满管（加药品千万注意别让药品污染桌面及手上，有必要可带面罩），剧烈震荡后12000rpm离心10min，取上清加入500µl氯仿/异戊醇12000rpm离心10min。4.取上清至预冷600µl异丙醇和20µl3MKAc中置于-20℃冰箱中15-20min。5.12000rpm离心5min。去上清在吸水纸上倒置60s，加入-20℃预冷无水乙醇800ul，-20℃冰箱中静止30min,取出后12000rpm离心5min；重复1次，去上清。6.放入真空干燥箱中干燥10min即可。7.加入90µlTE和15µlRnase，37℃水浴1h得到DNA原液，于-20℃条件下保存备用。分析：由以上实验数据可知，提取到的DNA的量很少，是白色粉末物质，其原因可能是在加入600ul异丙醇和20ul3MKAc后没有混合均匀就放于-20C冰箱放置，以致DNA只有少量沉淀下来，大量DNA都倒掉了实验不理想的原因，得到DNA原液少1．在研磨青皮嫩叶时用力过猛，导致部分叶子溅出研钵2．在离心时，由于EP管盖子没盖紧，或是质量不好，破损3．加入氯仿/异戊醇后没有混合均匀就进行离心实验二DNA纯度、浓度与分子量测定实验目的：学习检测DNA的纯度、浓度与相对分子量大小的基本原理与方法。实验原理：DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm。分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于1.75，低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质。根据经验数据，当样品DNA的OD260/OD280为1.8-2.0时，认为已达到所要求的纯度。OD260值为1的溶液大约含50ug/mLDNA，故DNA的浓度（ug/mL）=OD260值*50mg/L*稀释倍数DNA总量（ug）=DNA浓度（ug/mL）×总体积（mL）DNA分子量大小测定，可用含GV的2%琼脂糖电泳法测定，根据加入标准片段的电泳迁移距离计算样品片段分子量大小，此技术还可以作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。仪器、材料与试剂主要仪器：紫外分光光度计、电泳装置、凝胶成像系统主要试剂和材料：GV、溴酚蓝、TBE缓冲液、琼脂糖、DL2000实验步骤：预热紫外分光光度计，设定测定所用波段（260nm、280nm）3取5µlDNA原液放入微量石英比色皿，加入95µl的TE缓冲液；用TE缓冲液作为空白对照，对样品分别进行检测，并记下读数；计算DNA的含量；根据DNA的A260/A280值判断其纯度；称取0.6g的Agarose琼脂糖，加入30mL0.5×TBE，在电热炉上进行加热，使琼脂糖溶化；等琼脂粉完全煮沸，冷却至大约55℃时，加入2µl的GV并混匀；将凝胶倒入胶室中，并将梳子垂直插在移胶板块上方；等凝胶完全凝固后（约30min），将梳子垂直取出；将凝胶体放入加有0.5×TBE电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液没过凝胶约0.5cm；取1µl6×LoadingBuffer(上样缓冲液)与5µlDNA原液混匀后，加到凝胶孔中；加入3µlDL2000;盖好电泳槽盖，选择适当的电泳电压（90V）电泳45min；切断电泳仪电流，取出凝胶置于紫外灯下观察，摄像保存。五、实验结果与分析：结果如图一。由于仪器的原因，没能检测DNA的纯度。青皮DNA电泳，点了7个样，只有5号管有较暗条带无拖尾，分子量大于2000bp，与相关资料相符。为什么只有一管有DNA条带，可能是细胞裂解时，EP管内的材料没能充分破碎。还有可能是在震荡混匀过于剧烈，对DNA造成严重的机械损伤实验三聚合酶链式反应（PCR）(聚合酶链式反应扩增特定的基因片段)模板：N基因上游引物：NP-1：5’-TAGGATCCCCGGAAAGAGTCTTTGC-3’下游引物：NP-2：5’-GCGGAGCTCTTTACTGCTCAAAAACATTTAATTG-3’PCR反应体系：PCR反应体系：成分10*BufferMg2+dNTPNP-1NP-2Tag酶ddH20模板单管（50ul）5ul3ul1ul1ul1ul1ul37．5ul0．5ulPCR反应条件：94℃3min→30循环→94℃30s→55℃30s→72℃1min→72℃10min（4℃保温）实验原理：在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和4适宜的缓冲液。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。实验准备：模板、Taq酶、10×Buffer(不含Mg2+)、dNTP(10mM)、灭菌ddH2O（分装1.5mlEP管中）、10µl200µl1000µl吸头自备、50µlPCR管（平盖）、10µl200µl移液枪、冰块实验结果：PCR后产物16管实验结果与分析：N-基因体外扩增完成后，保存好，待以后实验使用实验注意事项：1．本实验共做16管，由于每管中每种成分的量都很少，因此应该先把除模板外的其它成分的量都加入一个较大的EP管中，混合均匀后再按量分别加入16个EP管中，最后再加入模板，以减少实验误差。实实验四克隆目的DNA片段回收一、实验目的：了解、练习使用试剂盒回收DNA。二、实验原理：回收DNA实验中两个最重要的技术指标是产物的纯度与回收率：纯度未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；回收率不理想时往往会大大增加前期工作量。回收方法常有：1、低熔点胶法：低熔点胶是向普通琼脂糖的多糖链上引入羟乙基形成的，这一变化会使凝胶的熔化点与凝固点均降低。低熔点胶在30℃时凝结、65℃时熔化，这一温度尚不足以使DNA分子变性。操作时可先灌一块普通的胶，然后用低熔点胶取代其中的回收部分。割下的胶加入TE后于65℃保温促使凝胶熔化，再加入等体积的酚抽提去除凝胶。低熔点胶的另一个特点是电泳回收后可以立即进行酶切连接、标记等酶反应，因为这类胶中不含有普通琼脂糖中抑制酶活性的硫酸盐等杂质，并且收集的胶条能在酶反应的合适温度(37℃)始终保持液体状态。2、玻璃粉(乳)法：将胶条割下加入NaI溶液浸泡，剧烈振荡数分钟促使溶胶。向胶液中加入经酸净化处理的极细玻璃粉(乳)，室温反复倒转离心管使DNA吸附于其上。离心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保温，洗脱吸附于玻璃粉上DNA，再次离心收集含DNA的上清液即可。玻璃粉法适用于回收0.4～1kb的小分子片段，均有80％的回收率。3、QIAgen胶回收试剂盒：由于凝胶溶于含NaI的溶胶液，DNA能专一地与离心柱中纤维素结合。结合后的DNA经洗涤除去杂质，最后在低盐缓冲液中经离心从纤维素上洗脱下来。4本实验采用试剂盒回收，具体操作按照说明书完成。三、仪器、材料与试剂：琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（20次）、琼脂糖、核酸电泳装置、DNA分子量标准2000bp一支（DL2000）、凝胶成像系仪、紫外观察箱、灭菌ddH2O、灭菌10µl枪头、灭菌PCR管、灭菌1.5mlEP管。四、实验步骤：51.电泳：2%琼脂糖凝胶电泳实验三中的PCR产物，将0.6g琼脂糖加入30mL0.5×TBE中于电热炉上加热溶解，温度降至手能忍受程度时加入GV混匀后倒板制胶（用宽齿梳子），凝固备用。每组尽量将点样空点满，但不要外溢，第一个点样空点DL2000，100V电泳45min，凝胶成像，拍照，千万别丢掉。2.目的片段回收：在紫外观察箱中小心将目的条带切下放于已灭菌EP管中（事先称取该EP管重量）加入3倍体积溶胶液，50℃温浴至胶完全溶解，以下过程参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书，最后洗脱体系30ul。⑴、在紫外观察箱中小心切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽表面液体并切碎，放于已灭菌并称量过的EP管中，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积（1g等于1ml）。⑵、加入3倍体积BufferDE－A，混合均匀后置于75℃加热至胶完全溶解。⑶、加入0.5个BufferDE－A体积的BufferDE－B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入一个体积的异丙醇。⑷、吸取混合液并转移至DNA制备管中，置于2ml离心管中，12000×g离心1min，弃滤液。⑸、将制备管置回2ml离心管，加500ulBufferW1，12000×g离心30s，弃滤液。⑹、将制备管置回2ml离心管，加700ulbufferW2，12000×g离心30s，弃滤液。再加700ulbufferW2洗涤一次，12000×g离心1min，弃滤液。⑺、将制备管置回2ml离心管，12000×g离心1min。⑻、将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加入已预热的30ulEluent，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。五、试验结果与分析：实际电泳如图二，理论电泳如图三。电泳的时候没有跑出N—基因的条带来。总做了两次PCR，最终都以失败告终。第一次电泳失败，条带小于100bp，可能为引物，原因可能是N-基因加错了或其他药品加错了。第二次因移液枪使用不正确，导致PCR体系配制时各成分量没有一一对应，从而电泳失败，条带小于100bp，所以采用