实验六植物总RNA的提取及检测

实验六植物总RNA的提取实验原理：LiCl最终浓度为2mol/L0.8mol/L直接沉淀大分子RNA（包括rRNA和mRNA）需要注意的是Li离子对反转录酶有抑制作用，而Cl离子能抑制蛋白质合成的起始步骤，所以在mRNA反转录和体外翻译实验前不要使用LiCl沉淀DNA和RNA①所用所有试剂：Tris-CTAB：与RNA结合β-巯基乙醇：防止被氧化Tris饱和酚、氯仿：去蛋白质5LLiCl、无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc：使RNA沉淀1×TAE、BW：配制凝胶Gol-rad或gold-view和6×loadingbuffer:前沿指示剂ddH2O②所有材料用具试剂瓶、250烧杯玻璃棒250容量瓶记号笔天平一次性手套钥匙、液氮研钵、冰、线手套、枪、枪头、高压锅、电泳照相系统离心机、混摇机、恒温水浴、电泳仪、电泳槽③实验准备：1、CTAB5g直接加入试剂瓶（防止起泡）2、NaCl20.44g+0.5MEDTA12.5ml用ddH2O定容至225ml3、空瓶贴标签加适量（100或50ml）的ddH2OLiClNaAc70%乙醇氯仿ddH2O4、6个瓶+0.1%DEPC在通风橱里戴双层手套，充分摇匀，气泡不很快消失5、37度保温过夜注意事项：试剂瓶用洗洁精水浸泡一个小时，然后清水冲到不起泡，壁上不挂水珠，再用ddH2O冲两次，量筒等量器清洗后都用ddH2O冲洗两次Tris不可用0.1%DEPC处理，等其他组分处理完再加到CTAB中所有瓶子用0.1%DEPC处理，除了β-巯基乙醇，Tris饱和酚（购买时小瓶装，直接用即可）所有水溶试剂用ddH2O配置加样器100-1000规格的，小于100则不准确实验流程1.3-5倍体积（650ulTris-CTAB提取缓冲液，50ulβ-巯基乙醇）的65度预热的提取缓冲液，混匀2.根据实验需要，取每管0.1-0.5g叶片置液氮中冷冻，研磨成粉末。首先将研钵、杵和钥匙充分冷冻（浇3-4次），加入叶片，加液氮，不超过五次。液氮多的时候轻磨，快没时用劲快磨，至白色为止。3.粉末加入准备好的离心管中，大概2匙柄，充分混匀，放在65度恒温浴中15min，每隔2-3min摇一次，研钵和杵放水下冲，氯仿瓶放在冰中。4.加入一倍体积（700ul）的氯仿，用混摇机摇匀，12000rpm,离心10min,取上清。5.在冰中准备好离心管和氯仿，重复一次。6.准备好550ul5mol/LLiCl，350ul冷无水乙醇，60ul3mol/LNaAc，加入430ul上清液，静置15-30min，沉淀RNA7.12000rpm离心10min，注意放的方向，抽去上清，RNA沉淀为无色胶体状8.用70%乙醇漂洗两次，切忌快速抽打，开口在通风橱里风干（大概15min），再加入20ul的ddH2O，反复抽打混匀，置于冰中备用。注意事项1、整个实验过程禁止说话，即在没有条件的情况下，尽量创造一个无RNA酶的环境2、实验提取过程尽量缩短时间,尽可能放在冰上3、RNA沉淀为无色胶体状，白色明显沉淀是蛋白质等杂质4、清洗RNA沉淀时确保沉淀不被冲走，确定其溶解在水中5、电泳点样一定要迅速，准确，均匀