细胞破碎、蛋白质复性、固液分离

生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性本章内容细胞破碎、蛋白质复性和固液分离本章介绍的细胞破碎和固液分离操作属于初级分离阶段。它们主要影响产物的收率，但在某种意义上也影响产物的纯度，因为如果能在初级分离中除掉大部分杂质，特别是一些对后续精制阶段有干扰的杂质，那么产物精制也会变得较容易，纯度也容易得到保证。第一节、细胞破碎自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃，产品的数量越来越多，许多具有重大应用价值的产品应运而生，如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素等，它们的基因分别在宿主细胞（如大肠杆菌、酵母或动物细胞）内克隆表达，称为基因工程产物，从而提高了产量，降低了成本。有的基因工程产物是胞内物质，分离提取这类产物时，必须破坏细胞膜，使产物得以释放，才能进一步提取。由于常用的手段通常是将整个细胞破碎，因此习惯上将该操作称为细胞破碎。细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，它直接影响产物的活性、收率和成本。一、细胞壁的组成与结构细胞破碎的目的是破坏细胞外围使胞内物质释放出来。微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜，它们起着支撑细胞的作用。其中细胞壁为外壁，具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤或渗透压破坏的功能。细胞膜为内壁，是一层具有高度选择性的半透膜，控制细胞内外一些物质的交换渗透作用。细胞膜的结构细胞膜较薄，厚度为7~10nm，主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和环境因素。为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解它们的组成和结构。肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成分，它是一个大分子复合体，有多糖链借短肽交联而成。这些短肽连接在N-乙酰胞壁酸的残基上，相邻的短肽又交叉相连，形成了机械性强度很大的网状结构。1、细菌细胞壁细胞破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链上所存在的肽键数量和其交联的程度。交联程度越大，网状结构就越致密，破碎的难度也就越大。革兰氏阳性细菌的细胞壁与革兰氏阴性细菌有很大不同。革兰氏阳性细菌的细胞壁结构革兰氏阳性（G+）细菌的细胞壁具有较厚（20-80nm）由致密的肽聚糖层组成,磷壁酸：是革兰氏阳性菌的特有的成分，可加强肽聚糖的结构。革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，主要由肽聚糖组成（占40%~90%），其余是多糖和胞壁酸。其肽聚糖结构为多层网状结构，其中75%的肽聚糖亚单位相互交联，网格致密坚固。革兰氏阴性细菌的细胞壁革兰氏阴性细菌的外膜壁膜间隙O-特异多糖(O-polysaccharide)核心多糖(core-polysaccharide)蛋白质类脂A(LipidA)孔蛋白(脂多糖)磷脂分子脂蛋白革兰氏阴性细菌的细胞壁包括内壁层和外壁层，内壁层较薄（2~3nm），由肽聚糖组成；外壁层较厚（8~10nm），主要由脂蛋白和脂多糖组成。革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚糖为单层网状结构，它们只有30%的肽聚糖亚单位彼此交联，故其网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固，显得比较疏松。2、酵母菌细胞壁酵母菌细胞壁比革兰氏阳性细菌要厚，大多为100~300nm，但不及革兰氏阳性细菌细胞壁坚韧。幼细胞的细胞壁胶薄，有弹性，以后逐渐变厚、变硬。研究表明，有可能仅有一部分厚度对细胞壁的刚性和强度起重要作用。酵母细胞壁有特殊的酵母纤维素构成，其主要成分是葡聚糖（30%~34%）、甘露聚糖（30%）、蛋白质（6%~8%）和脂类，不含一般真菌所具有的几丁质或纤维素。细胞壁的结构可分为三层。最里层为葡聚糖层，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状。外层是甘露聚糖层，也是一种分支聚合物。葡聚糖层与甘露聚糖层之间靠处于中间的蛋白质交联起来，形成网状机构。近10%的甘露聚糖的侧链通过磷酸二酯键与磷酸连接。同细菌细胞壁一样，酵母细胞壁破碎的阻力主要决定于细胞壁结构交联的紧密程度和它的厚度。3、霉菌细胞壁由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。霉菌细胞壁厚度100~250nm，主要由多糖组成（80%~90%），其次含有较少的蛋白质和脂类。不同的霉菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成的。红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图植物细胞壁的结构对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～3μm），富有弹性。由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。植物细胞初生壁的化学组成组分结构和分类纤维素β－1，4－D－葡聚糖半纤维素木葡聚糖甘露聚糖木聚糖(包括阿拉伯木聚糖和4-0-甲基-葡萄糖醛酸木聚糖）果胶物质半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白质结构蛋白各种酶类凝集素某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。4、细胞壁结构与细胞破碎微生物细胞壁的形状和强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。各种微生物细胞壁的组成和结构差异很大，取决于遗传信息、培养生长环境和菌龄。此外，霉菌的细胞壁结构还随培养过程中机械搅拌作用的强弱而变化。在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎难易程度的重要因素。显然，细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。虽然通过改变遗传密码或培养的环境因素可改变细胞壁的结构，但到目前为止还没有足够数据表明利用这些方法可提高机械破碎的破碎率。在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞壁的组成显得特别重要，其次是细胞壁的结构。了解细胞壁的组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化学试剂，以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确定其使用的顺序。二、细胞破碎技术的分类细胞破碎方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。破碎方式机械法非机械法固体剪切液体剪切作用作用珠磨法高压匀浆干燥处理溶胞作用酶溶法化学法物理法超声破碎压榨机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理三、几种常用的破碎方法1、高压匀浆法（high-pressurehomogenization）2、高速珠磨法（high-speedbeadmill）3、超声破碎（ultrasonication）4、化学渗透法（Chemicalpermeation）5、酶溶法（enzymaticlysis）6、微波加热法（microwaveheating）7、其他方法1、高压匀浆法高压匀浆法所用设备是高压匀浆器（Highpressurehomogenizer），最早用于牛奶的匀浆化，使奶质均匀，不产生分层、成膜现象。作用机理从高压室（几十兆帕）压出的细胞悬浮液经过阀座3的中心孔道从阀座3和阀杆5之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速喷出的浆液又射到静止的碰撞环4上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列过程中经历了高流速下的剪切、碰撞以及由高压到常压（出口处压力）的变化，使细胞产生较大的形变，导致细胞壁的破坏。细胞壁是细胞的机械屏障，稍有破坏就会造成细胞膜的破坏，胞内物质在渗透压作用下释放出来。高压匀浆器各种阀型设计刀型阀锥型阀球型细胞破碎阀锯齿阀细胞破碎阀标准阀细胞悬浮液经过一次高压匀浆后，常常只有一部分细胞破碎，不能达到100%的细胞破碎率。为此，需要在收集完破碎液（通常称为“细胞匀浆”）后进行第二次、第三次或更多次的破碎，这是高压匀浆法的缺点。为避免操作烦琐，也可以将细胞匀浆进行循环破碎，但要避免过度破碎带来产物的损失，以及细胞碎片进一步变小，影响后面对碎片的分离。被破碎的破碎率符合如下公式：ln[1/(1-R)]=KNPɑ式中R—破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放量Rn与最大释放量Rm之比；K－与温度、粘度等有关的破碎速度常数；P－操作压力，MPa；ɑ－与微生物种类有关的常数。升高压力有利于破碎，减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。Brokman等人已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验表明在约175MPa的压力下，破碎率可达100％，但压力大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明压力超过一定值时，破碎率增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。影响高压匀浆器细胞破碎因素破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。破碎中需关心活性物质在破碎过程中的失活问题，研究表明蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的热引起。如果能将温度控制在35℃以下，那么酶活损失可以忽略。对于温度敏感性物质低温操作是必需的。高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却。尽管提高压力有利于细胞破碎，但是提高压力需增加能耗（3.5kW/100MPa），同时为移走产生的热量（23.8℃/100Mpa）需要付出代价。机械破碎的能耗主要包括提供动力（如压力）消耗的能量以及低温操作耗费的能量。高压匀浆法适用的范围—大规模细胞破碎的常用方法☆高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。☆不宜使用高压匀浆法：易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类：WAB公司的AVPGaulin31MR型最大操作压力为24MPa最大处理量为为100dm3/hBranandluebbe公司SHL40型最大操作压力为20-63MPa最大处理量为为2.6-34m3/h2、高速珠磨法微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂（通常是d1mm的无铅玻璃珠、石英砂、氧化铝）在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释出内含物。磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的圆盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃小珠相互搅动；细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起；在出口处，旋转圆盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻璃小珠，使不被料液带出。由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻璃小珠。德国Net