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血清中食物过敏原IgG的测定方法：ELISA间接法试剂：八种食物抗原、血清样品、Goatanti-humanIgG-HRP（santacruzbiotechnology/ThermoFisherScientific）、包被液(碳酸盐缓冲液/CBS)、封闭液（5%BSA+PBST）、洗涤液（PBST），稀释液（1%BSA+PBST），底物（TMB），中止液（2MH2SO4）。实验步骤：1.血清收集保存：收集不抗凝血液3-5ml，保存4℃冰箱中，在恒温离心机中以4℃，3500r离心10min，收集上层血清，以200ul/管分管编号冻存-80℃冰箱中。2.包被：用包被液（CBS）稀释八种抗原至5ug/ml，以100ul/孔加入酶标板中，空白孔加100ul/孔3%BSA+PBS.,4℃放置过夜12h上。3.同一酶标板加入同一种抗原1234567891011121RA1RA2RA3RA4RA4RA6正常1正常2正常3正常4正常5正常62RA1RA2RA3RA4RA4RA6正常1正常2正常3正常4正常5正常63RA1RA2RA3RA4RA4RA6正常1正常2正常3正常4正常5正常64空类1空白2空白3空白4空白5空白6空正1空正2空正3空正4空正5空正65空白1空白2空白3空白4空白5空白6空正1空正2空正3空正4空正5空正66空白1空白2空白3空白4空白5空白6空正1空正2空正3空正4空正5空正67阴性阴性阴性//////备用备用备用4.封闭：弃上清液，加封闭液（5%BSA+PBST）200ul/孔，37℃放置2h。5.洗涤：以洗涤液洗涤5次，5min/次。6.加血清样品：将冻存血清逐级解冻至室温，将待测血清（1:30稀释于1%BSA+PBST）中，以100ul/孔加入酶标本中，37℃放置2h，阴性对照孔加100ul/孔稀释液（1%BSA+PBST）.6.洗涤：用洗涤液洗涤5次，5min/次。7.加酶标二抗：人抗IgG抗体-HRP,用1%BSA+PBST液1：10000稀释，100ul/孔，37℃恒温箱温育2h。8.洗涤：洗涤液洗涤5次，5min/次。9.显色：加新鲜配制的底物（TMB：A液和B液等体积混合）100ul/孔。10.中止反应、比色：加50ul/孔中止液（2MH2SO4），用酶标仪测定吸收值（450nm），根据P/N确定阳性值。1血清特异性IgE检测小鼠检测完AHR后24h内处死动物，摘眼球取血，室温下静置30min，4℃4000rmp/min离心10min，小心吸取上层血清，分装-80℃保存备用。采用间接ELISA法测定血清特异性血清特异性IgE水平。具体步骤为：包被100μl1μg/mlDerf1蛋白，4℃孵育过夜；200μl3%BSA-PBS封闭，37℃孵育2h，PBST洗板5次；用1%BSA-PBST将小鼠血清按1:5稀释，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板5次；用1%BSA-PBST将生物素标记的羊抗鼠IgE按1:2000稀释，100μl/孔，37℃孵育2h，PBST洗板5次；用1%BSA-PBST将HRP标记的链霉亲和素按1:5000稀释，100μl/孔，37℃孵育2h，PBST洗板5次；TMB显色，37℃避光孵育5-10min；50μl2mol/L的硫酸终止反应，450nm比色。2血清特异性IgG2a、IgG1检测从-80℃冰箱取出保存的血清，置于4℃缓慢解冻。包被100μl1μg/mlDerf1蛋白，4℃孵育过夜；200μl3%BSA-PBS封闭，37℃孵育2h，PBST洗板5次；用1%BSA-PBST将小鼠血清按1:1000稀释，100μl/孔，37℃孵育2h，PBST洗板5次；用1%BSA-PBST将HRP标记的羊抗鼠IgG2a和IgG1按1:2000稀释，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板5次；TMB显色，37℃避光孵育5-10min；50μl2mol/L的硫酸终止反应，450nm比色。Westernblot一、SDS-聚丙烯凝胶电泳二、转膜1.准备好转膜用的物品：转膜夹、剪刀、镊子、纤维素膜、滤纸，盘子，转膜液（不加SDS，有气泡）2.将滤纸侵泡于盘中的转膜液，赶走气泡，将膜剪去一角做标记，侵泡于甲醇中，根据黑胶白膜原则叠好，保证无气泡后夹紧放入电泳槽中，黑对黑原则放入电泳槽，槽内放入冰袋，盖好电泳槽盖。3.于冰上或者冰箱中低温转膜，恒流300mA，40min三、封闭（正面朝上）TBS洗5min配3%BSA-TBS摇几分钟4℃过夜，（100mlTBS中加入3gBSA胎牛血清，0.21g7ml）四、加一抗，倒去封闭液，用TBS冲洗一次，TBST5min×3次（大概10ml），加入用1%BSA-TBST稀释的一抗室温摇2h（1：5）五、加二抗：倒去一抗或回收（TBST,5min×3次）用1%BSA-TBST按2000:1稀释二抗（鼠抗人IgE抗体），室温摇2h（有的已经与HRP结合的，如若没有，后面加HRP）六、加HRP（链霉亲和素）：TBST洗5min×3次用1%BA年SA-TBST按5000:1稀释HRP，室温摇1.5h七、DAB显色：TBST洗5min×3次，然后TBS洗5min×3A1滴+B2滴+C1滴+1ml纯水，至条带显色自来水冲洗至无背景即可八、拍照：用保鲜膜装去离子水，保存于4℃冰箱背景高的原因：1.延长封闭时间2.用去脂牛奶5%封闭3.Ⅰ抗Ⅱ抗用封闭液稀释4.降低二抗浓度，缩短孵育时间