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【摘要】分析基层中心血站实验室手工操作ELISA时，影响检测结果的相关因素。分别对用于临床ELISA测定标本收集、试剂准备，加样、温育时间与温度控制，洗板，以OPD和TMB为底物的显色，比色测定及报告结果和准确解释行问题进行探讨。对受血者和献血者采用ELISA定性和定量测定操作简便可行。【关键词】酶联免疫吸附试验献血质量控制在血站质量管理工作中，检测试剂质量优劣直接影响到临床用血安全和血液检测的准确率。基层中心血站实验室ELISA测定现通常采用手工操作,以微孔板条为固相的测定模式。任何一个步骤处理不当都会影响测定结果，因此最大限度地保证检测结果的可靠及输血的安全就显得十分重要。1临床标本的收集和保存用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）其次为唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。血清标本测定的标志物为传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、特种蛋白时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面：1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，故在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色［1］。2）样本的采集及血清分离中要注意避免细菌污染。细菌生长分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；此外一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。3）血清标本如是以无菌操作分离，则可在2～8℃下保存1周。如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存应在-70℃以下。4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间对测定结果产生影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。此外体位对测定结果亦有影响，当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。2ELISA测定中试剂准备在临床实验室作实验时通常将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂准备最关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定。以使试剂盒在使用前与室温平衡。其目的是在后面的温育反应步骤中，使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。3加血清样本及反应试剂在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意避免以下几点：加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要。滴加太快易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。故有时一份标本用相同的试剂盒两次测定结果不同，往往是上述加样及试剂的错误所致［2］。4温育的时间与温度温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。ELISA作为一种固相免疫测定，必须在一定的温度条件下反应一定的时间，且温育所需时间与温度成负相关性。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。目前ELISA商品试剂盒，国产反应温育时间为37℃30分钟～1小时，进口试剂盒为37℃1～2小时才能较完全的结合。温育实际测定操作中要注意以下几点：1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。在临床实验室中，通有将微孔板一放入温箱即开始计时，造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来。南方冬季室内温度较低应特别注意，此时微孔板转入温箱后37℃温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性［3］。为保证37℃下足够的温育时间，可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱所需时间孔内温度才能达到37℃，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。2）温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。3）“边缘效应”的排除。“边缘效应”指外周孔显色较中心孔深，原因为96孔板周孔与中心孔表面热力学梯度不同。使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可排除“边缘效应”，且可提高测定重复性。总而言之，尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中。这样因板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，水浴箱或湿盒内的高温度使反应溶液的温度迅速与温室平衡。5ELISA测定的洗板洗板对于ELISA测定是极其关键的一步。以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS。Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团。由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。ELISA测定的洗板有两种方式：1）手工洗板是在每次反应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放置2～3分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3～4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。2）洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板机进行，但每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留。使用洗板机到底洗多少次能达到要求，可进行下面这个简单的实验：选择4×8HBsAgELISA包被板条，每2×8孔分别加入相同一份弱阳性和一份阴性样本，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育。洗板均为4孔时，按第1排洗1次、第2排洗2次、第3排洗3次-直至第8排洗8次。加底物显色测定，如洗3次后，显色不再改变，即洗3次的板孔比色测定与4次、5次洗板的板孔的吸光度相同，阳性/阴性值保持最大不变，则可认定所用洗板机3次洗板即可达到要求［4］。6以OPD和TMB为底物的显色在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。37℃30分钟可使HRP的底物催化反应完全，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，以OPD为底物，配好后应为无色，则需避光进行，否则就不能使用。以TMB为底物，整个显色反应无需避光，显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定或肉眼判断结果。7ELISA的比色测定ELISA的比色测定由酶标仪进行测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等。这主要是未能正确理解和使用酶标仪所致。故需强调下面两点：1）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。在行ELISA测定时，以TMB（比色波长450nm）为底物和以OPD（比色波长492nm）为底物的试剂盒均有使用，滤光片需根据要求随时更换。故易出现滤光片错用的问题。2）单波长或双波长比色选择的问题。单波长比色以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长比色则在敏感波长450nm和非敏感波长630nm各测定1次。敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和。非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长与非敏感波长下的吸光度值的差。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，故而在ELISA测定比色时最好使用双波长比色。8ELISA测定结果判定临床ELISA测定结果分为定量和定性两大类。1）定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数值表示。它是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线（又称标准曲线）。2）定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。定性测定的“阳性”和“阳性”的判定依据必须是试剂盒所确定的阳性判定值（Cut-off）。以前很多基层实验室均使用卫生部临床检验中心供应的弱阳性定值质控血清（以前也称“临界值”血清）的测定吸光度来判定结果，高于其判为阳性，反之为阴性，而不管试剂盒Cut-off值如何。至今仍有一些实验室在坚持这种错误的做法应予纠正。9ELISA结果报告及解释临床ELISA测定结果的报告较为简单。定性测定报阴性或阳性即可；定量测定则报出具体的数值，结果解释比较起来要复杂得多。例如，对操作“两对半”结果的解释，不但要求检验者要知道不同的结果模式的临床意义，而且必须对乙肝病毒的分子生物学、分子的变异及其对表型的影响有更深层次的了解［5］。现在，检验不再是单纯的实验室测定，而已成为一门临床医学学科-检验医学，要求检验医师对所做的测定项目十分熟悉。为帮助大家分析查找临床ELISA测定中出现问题的可能原因（非试剂盒本身的原因），特对常见问题及原因归纳总结如下：1)弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。2）测定的重复性差（相同样本两次测定结果不一致）这是典型的由测定操作引起的问题，包括①加样本及试剂量不准；孔间不一致；②加样过快，孔间发生污染；③加错样本；④加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；⑤不同批号试剂盒中组分混用；⑥温育时间、洗板、显色时间不一致；⑦孔内污染杂物；⑧酶标仪滤光片不正确；⑨血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性等。3）白板（阳性对照不显色）①漏加酶结合物；②洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。③漏加显色剂A或B；④终止剂当显色剂使用。4）全部板孔均有显色①洗板不干净；②显色液变质；③加底物的吸光受酶污染；④洗板液受酶等污染。【参考文献】［1］张艳,王晓红,孙柳燕.ELISA法实验操作技术的探讨［J］.长春中医学院学报,1997,13(1):36［2］李洪波,刘美红.ELISA检测血液各项指标的影响因素分析［J］.职业与健康,2004,20(12):66［3］陈平,何秉洪,邹昌新,等.回顾分析手工操作ELISA实践存在的问题及其对策［J］.中国输血杂志,2001,14(增刊)139［4］何平.ELISA操作中应引起重视的两个问题［J］.现代检验医学杂志,2004,3:16